亲和纯化--高等生物分离工程讲座PPT.pptVIP

亲和纯化 本章主要内容 一、亲和层析 (一)亲和层析的原理 (二)亲和层析的特点 (三)亲和层析的基本概念 (四)亲和层析的基本操作 (五)亲和层析的应用与实例 二、金属鳌合层析 三、亲和膜 亲和层析Affinity Chromatography 酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等） 抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白， 凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体） 核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白） 细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。 （一）亲和层析的原理 　 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物 质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接 到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱， 当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大 分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其 他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生 物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离 提纯的目的。 (一)亲和层析的原理 亲和的一对分子中的一方以共价 键形式与不溶性载体相连，作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来 (一)亲和层析的原理 亲和结合包括以下几个方面的相互作用: 静电作用 亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时,产生静电引力。 氢键 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子,结合部位之间可以产生氢键作用。 疏水性相互作用 如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳香环或烃基链等疏水基,另一方的结合部位上也含有疏水区,则两者之间可发生疏水性相互作用。 配位键 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位,则两者之间可以通过金属配位键间接结合。 弱共价键 结合力较弱的可逆共价键。 (二)亲和层析的特点 (三)亲和层析的基本概念 亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性 亲和层析载体的性质与选择 1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质。 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 亲和层析载体的性质与选择 3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以应用受到限制。 4）聚丙烯酰胺凝胶：碳—碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，具有网状三维空间结构。注意避免接触强氧化剂，配基偶联后会使它的网格缩小，在一定程度上限制了它的应用。 亲和层析载体的性质与选择 5）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。 亲和层析配体的性质与选择 纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配体与生物分子之间的亲和力 亲和层析配体的性质与选择 (四)亲和层析的基本操作 1, 非特异性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配体结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低。 (四)亲和层析的基本操作 2, 特异性洗脱 使用特异的配体作为洗脱剂 使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性结合