【精品文档】端粒和端粒酶.pptVIP

端粒和端粒酶 Telomeres and Enzyme Telomerase Puzzles 1 DNA聚合酶特点(引物 方向5’→3’) 染色体复制之初可以由小RNA作引物起始合成,之后DNA聚合酶能以反链DNA为模板,以前合成的DNA为引物,合成新的DNA取代染色体中间的RNA引物; 线性染色体最末端的RNA引物无法被取代; 末端隐缩 Assumptions 1.复制前联体、环化（linear→circle） 2.发卡结构 3.可变末端（alterable terminal）多个短重复序列(short repetitive sequences) 4.蛋白质干预 Puzzles 2 1939年,潜心玉米遗传性状研究的 Barbara McClintock (因发现玉米的转座子获诺贝尔学奖)注意到:在减数分裂后期偶然产生的染色体断裂很容易重新融合起来形成“桥”,在紧接着的有丝分裂中,这种染色体“断裂---融合---桥---断裂”的循环不断继续。 Assumptions 染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端,它有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合. 科学家Hermann Muller将这种特殊结构命名为端粒(Telomere,在希腊语中,telos表示末端,meros表示片段). Experiments 四膜虫 四膜虫是一种特殊的模式生物，有两个细胞核。小核很稳定，含5对染色体，用于生殖传代；而大核在接合细胞的发育过程中，染色体可断裂成200—300个小染色体，端粒非常丰富。 Elizabeth Blackburn 1978年，Elizabeth Blackburn利用四膜虫纯化了rDNA,以rDNA为模板通过体外合成掺入dNTP的实验，推断出四膜虫的染色体上有由许多重复的5’-CCCCAA-3’六碱基序列组成的特殊结构区域，此区域即端粒。 人工染色体 1980年，Elizabeth Blackburn在会议上对这一重大发现的报告,引起了Jack Szostak的极大兴趣。 他那时候正试图在酿酒酵母中构建人工线性染色体，让它能够在细胞中像自然染色体一样复制。但当环状质粒线性化并转入细胞后，很快就被降解掉。 人工染色体 端粒序列的发现使Jack Szostak有机会把线性质粒末端连接到四膜虫的端粒DNA ，然后再倒入酵母细胞中。奇迹发生了：线性质粒不再被降解，而是在细胞内稳定存在并复制。 这是人工染色体的最早雏形，它使得DNA的大片段克隆成为可能，后来为人类基因组测序工作立下了汗马功劳。 端 粒----稳定线性染色体的末端结构 Def. 存在于染色体末端的一段特殊的DNA重复序列 端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中； 不同种类细胞的端粒重复单位不同，大多长约5—8bp; 端粒的结构与功能具有保守性. 端粒的功能 端粒酶活性的发现 Liz女士的实验室在研究四膜虫端粒序列的过程中还发现了一个有趣的现象:带着四膜虫端粒DNA的人工染色体导入到酵母后,被加上了酵母的端粒而不是四膜虫的端粒序列. 由于端粒是由重复序列组成的,当时人们普遍猜想同源重组是延伸端粒补偿染色体末端隐缩的机制.但是同源重组只能复制出更多本身的序列,为什么在四膜虫端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜虫本身的序列呢?这个现象是同源重组无力解释的. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验 四膜虫在接合细胞的大核发育过程中,大核产生了非常丰富的小染色体,每一个小染色体都在末端加上了端粒,可以推测:如果“酶”的假说成立,此时细胞内的酶活性应该是非常高的. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验 用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温育,试图在体外检测到这个酶的活性,看到端粒的延伸. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验 经过不断优化条件,尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA后,Carol通过曝光x光片,清楚地看到了“酶”的活性:在测序胶的同位素曝光片上,端粒底物明显被重新加上了DNA碱基,而且每六个碱基形成一条很深的带,与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合. Elizabeth Blackburn 和 Carol Greider 的实验 这种酶活性不依赖于DNA模板,只对四膜虫和酵母的端粒DNA进行延伸,而对随即序列的DNA底物不延伸;并且该活性不依赖于DNA聚合酶. 而同源重组对序列没有特异性要求,并且依赖于DNA聚合酶的活性. 至此,她们澄清了