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第三章 细胞培养专用微载体 动物细胞培养技术的发展史 萌芽实验： （1）1885年，德国人W Roux把鸡胚组织放在温热的盐水中维持其存活了10天。  （2）1887，Arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟子里，观察到白细胞的运动，并存活了一段时间。 实验缺陷：由于当时的培养基不理想，实验难以重复，不能断定观察到的是真正存活的健康组织或细胞。 论证实验： 1907年，美国胚胎学家Harrison，把蛙胚神经管区的一片组织植入蛙的淋巴血液凝块中，组织不仅存活几个星期，而且从培养的细胞中长出轴突。 成功：在于实验方法的设计，防止了细菌的污染；Harrison被称为“细胞培养之父”。 改进实验： （1）1910年，Burrows在悬滴培养法中用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。事实证明它比淋巴要好得多，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。（2）Burrows继续与其他同事Alexis Carrel合作，成功地培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠等动物的组织。 （3）Burrows和Carrel还证明，若把胚胎提取液（鸡胚匀浆的组织“汁”）与血浆混合使用，培养物可存活与生长得更好一些。 细胞培养技术的快速发展阶段 （1）20世纪40年代抗生素的发展、无菌技术的成熟，为动物细胞规模化的培养奠定了基础。 （2）1962 年，以Capstick等成功进行BHK细胞（幼年仓鼠肾细胞）的悬浮培养为标志，动物细胞进入了规模化生产阶段， 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。 （3）细胞培养始传我国是20世纪30年代。至50年代以后，细胞培养在我国逐步开展起来。 动物细胞培养技术的应用 1. 疫苗制备：疫苗工业早期：普遍使用人工病毒感染的兔子和牛作为病毒疫苗的来源；培养细胞为病毒的增殖提供了场所。举例：（1）Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺（2）2005年11月，美国国会紧急拨款71亿美元用于预防疾病疫苗的研制，其中28亿用于细胞培养，（3）科技日报2006年7月13日讯，美国密西根州动物科学实验室的科研小组日前宣布，他们利用细胞培养技术，开发出制造人类流感疫苗的新方法。 第一节 采用微载体培养贴壁细胞是当前最有发展前途的一种培养模式 微载体培养应用 此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过几十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。????使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。?? 悬浮培养的局限性 1、大部分哺乳动物细胞为贴壁依赖性细胞，需要附壁培养。 2、在培养过程中细胞易变异，潜在着致癌危险，培养病毒细胞有时会失去标记，使免疫能力降低，因此悬浮培养的动物细胞或生物制品主要用作诊断试剂，不宜直接用于人体。 3、悬浮培养的细胞密度低。 微载体培养优点 ●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高； ●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点； ●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况； ●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好； ●培养基利用率较高； ●放大容易； ●细胞收获过程不复杂； ●劳动强度小； ●培养系统占地面积和空间小 第二节 动物细胞在微载体上贴壁生长机理 原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。????贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。?? 贴壁依赖的动物细胞在微载体表面上增殖，可分为贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。 细胞能否贴在微载体表面上？ 一、取决于细胞与微载体接触的机率 二、取决于细胞与微载体的相融性 ，这又是与基质表面的化学一物理性质相关。 1. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操