第6章 外源基因的表达.pptVIP

第六章 外源基因的表达 基因表达技术是基因工程的核心技术之一．外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的． 　　＊　原核生物基因表达系统 　　＊　酵母基因表达系统 　　＊　植物基因表达系统 　　＊　动物基因表达系统 第一节 基因表达机理 外源基因的起始转录 转录起始的速率是基因表达的限速步骤. 选择可调控的启动子和相关的调控序列.启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后开始高效表达． 原核生物基因表达的启动子一般比较简单，可分为两大类：诱导型启动子和组成型启动子，前者如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子，后者如T7噬菌体的启动子． 外源基因在真核生物中的起始转录和表达相对复杂，启动子和增强子序列是外源基因在真核细胞中表达所必需的．真核生物基因表达的启动子也可分为诱导型和组成型等类型. 2 mRNA的延伸与稳定性 1) mRNA的延伸 衰减子位点（attenuators）：类似于简单的终止　子，在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间．在构建表达载体时要尽量避免该序列的存在． 抗终止的序列元件（antitermination）． Poly(A)掺入信号序列：AAUAAA 2) mRNA的稳定性 　 mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少．对原核细　胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体　　菌．对真核细胞来说，则需要考虑增加mRNA的正确　加工，提高成熟mRNA的稳定性． 3 外源基因mRNA的有效翻译 1)原核生物外源基因mRNA有效翻译基本原则 * AUG（ATG）是首选的起始密码子． * SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的的4个碱基． * SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3?9个碱基． * 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构． 2)真核生物基因mRNA有效翻译 非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列5 -CCA（G）CCATGG- 3，如果改变这一序列，可使翻译的起始效率大大降低． 4 表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素．蛋白质水解是一个有选择的、精细调控的过程，它会影响外源基因表达产物在细胞中的积累． ＊　构建融合蛋白表达系统． ＊　构建分泌蛋白表达系统． ＊　构建包涵体表达系统． ＊　选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统 5 目的基因沉默 基因沉默（gene silencing）是导致外源基因不能正常表达的重要因素． 位置效应基因沉默：基因在基因组中的位置对其表达的影响．在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基因的表达密切相关． 转录水平的基因沉默：在DNA水平上的基因调控，主要是由于启动子的甲基化或外源基因的异染色质化而引起的． 转录后水平的基因沉默：在RNA水平上的基因调控，比转录水平的基因沉默更普遍．共抑制(cosuppression)是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制． 第二节 基因表达的调控元件 1 启动子 启动子（promoter）是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游．其长度因生物的种类而异，一般不超过200bp．一旦RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上，即可启动转录．启动子是基因表达调控的重要顺式元件． 启动子特性 序列特异性．在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动的滞后和转录速度的减慢． 方向性．启动子是一种有方向性的顺式调控元件，在正反两种方向中只有一种具有启动功能． 位置特性．启动子只能位于所启动转录基因的上游或基因内的前端，处于基因的下游或在基因的上游但离所要启动的基因太远，一般都不会起作用． 种属特异性．原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动子． 原核生物启动子 真核生物启动子 I型启动子。I型启动子所属基因编码的产物为rRNA 　前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。 Ⅱ型启动子。Ⅱ型启动子所属的基因绝大多数为编　 码蛋白质。 * 启动子基本区:转录起始点及邻近的TATA框。 * 启动子辅助区由多个位置不定保守序列组成． 　 * GC框:起始位点上游-100?-300位置GGGCGG序列． Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位