慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究 张子衡 张益民（汕头大学医学院第一附属医院神经外科 广东汕头 515041） 【中图分类号】R741【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）19-0053-04 【摘要】目的 探讨以慢病毒（Lentivirus, LV）为载体，转染绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）基因至神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的方法，观察其转染效率。方法 应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0 和pHelper2.0经脂质体转染重组，构建成表达GFP的慢病毒载体（Lentiviral vector-GFP,LV-GFP）。并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞，采用无血清培养法，进行体外培养、扩增。取经过5次传代神经干细胞，以1times;105个细胞/500mu;l/孔接种于24孔板，分别按复感染指数（Multiplicities of infection,MOIs值）为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100mu;l,每一滴度加六孔,共六组。48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率，并在72小时后进行神经干细胞球进行计数，以观LV-GFP对NSCs增殖的影响。并行流式细胞仪检测，得出各组NSCs的 GFP阳性转染率。结果 除MOI值为0的对照组外，48～72小时后各孔均有GFP表达。MOI值从0增至10，细胞的阳性表达率逐渐提高(Plt;0.05)，MOI值为10的组能获得gt;90%的转染率。但MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(Plt;0.05)。结论 LV是将目的基因转入NSCs的理想载体。以MOI为10的滴度，LV可将GFP基因高效转入神经干细胞内并表达。 【关键词】神经干细胞 慢病毒载体 转基因 绿色荧光蛋白 中枢神经系统的常见疾病如Parkinson,s病、中风、多发性硬化及脊髓损伤等主要由神经元和神经胶质细胞结构和功能的缺失引起，应用干细胞移植技术来治疗上述疾病的基础研究已取得一定进展。近年来，随着基因技术的进步，利用有效的载体，可将外源基因转入干细胞，从而有望获得干细胞移植和基因治疗的双重效果。本实验中我们以LV为载体，将报告基因GFP基因转入NSCs中，研究其转染条件和方法，观察其转染效率及报告基因表达情况，为进一步的系列研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1实验动物及器械 孕14天Sprague-Dawley大鼠1只（由北京协和医院实验动物中心提供）,15ml离心管（Corning，Mexico）, 低温离心机（Lock-Song,北京路科顺高新技术有限公司），一次性200目尼龙细胞筛（BD Falcon,美国），24孔培养板（Corning,美国）， 25cm2细胞培养瓶（Corning,美国），CO2恒温培养箱（Thermo forma 3110 series, 美国），倒置荧光显微镜（Leica,德国）。 1.2 实验试剂 干细胞培养液：DMEM/F12培养液（Gibco ,美国）,添加碱性成纤维细胞生长因子（20ng/ml，CYTOLAB/PEPROTECH Asia,美国)、表皮细胞生长因子20ng/ml，CYTOLAB/PEPROTECH Asia,美国)，1%浓度的N2和2%浓度的B27添加剂（Invitrogen,美国），谷氨酰胺(2mmol/ml,Hyclone, 美国)、青霉素（10u/ml, Gibco ,美国）、链霉素（10mg/ml, Gibco ,美国）。4℃保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ,美国），胎牛血清（Invitrogen,美国），鼠抗大鼠Nestin抗体（Chemicon,美国），FITC-标记羊抗鼠Ig（Jackson, 美国），构建慢病毒的三种质粒pGC-E1-GFP、pHelper 1.0 和 Helper 2.0，以及包装细胞293T（由上海吉凯基因化学技术有限公司提供）。 1.3 神经干细胞的分离、培养和鉴定 ① CO2麻醉处死孕鼠，无菌条件下取出胎鼠;②用预冷的D-hank液漂洗数次后，取其脑组织，显微镜下剥离表面的血管及脑膜，移至无菌培养皿，???成约1mm3大小的碎块，后再用D-hank液漂洗2次；③加入3～5倍体积的0.25%胰蛋白酶，37℃水浴8分钟，用吸管轻轻吹成单细胞悬液，加入血清终止消化；④用200目的细胞筛过滤，滤液移入离心管，在4℃条件下以1000rpm转速离心5分钟