中山大学遗传学课件 第6章 基因组水平上的遗传学.ppt

RFLP 的应用 RFLP作为人类基因组的一种遗传标记，其中许多已经定位。在此基础上，只要证明某一基因与某一限制性片段多态性连锁紧密，则两者必定在同一染色体上相邻的位置。有时作为病因的cDNA虽已分离，但其变异性质不明，或致病基因本身不明时，通过家系分析知道某一RFLP标记与致病基因连锁，同样可以利用这一RFLP对该致病基因的遗传进行分析（基因诊断）。 分子生态学上的亲缘关系或进化关系分析。 RFLP的局限性 首先，它是基于一个或少数几个核苷酸的改变所造成的限制性酶切点的“能切”或“不能切”两种状态，因而所产生的不同长度的酶切片断一般也只有2-3个，能提供的多态性信息量有限；其次，有的核苷酸的改变是不能用限制性内切酶检出的；再次，检测某个座位的RFLP需要该座位的DNA片段作为探针，进行定点分析，并且需要放射性同位素标记与Southern blot杂交技术，因此存在着工作环境和费用等问题。 小卫星标记 1985年，英国的A.Jefferys等在人的肌球蛋白基因中发现了一些短的简单重复单位，称为“小卫星”。随后人们已证明在人类基因组中分布有大量的此类长度的多态性标记，在某一点上，可能只有一个重复单位，但更多的情况是成簇的，即以正向或反向串联重复，并分布于基因组的各个部位。在某一点上，数量可变的串联重复（variable number of tandem repeats, VNTR）(重复单位为6-12个核苷酸)可提供不同长度的片断。 微卫星标记 1989年被发现和建立，它们的重复单位为2-6个核苷酸，被称为“微卫星或短串联重复（STR）”。STR有三个最突出的优点：一是高度多态性，由于（CA）n等简短重复不受进化上的选择，因而在同一位点上数目变化很大，在人群中因重复次数不同而产生等位片段，可形成多达几十种的多态性；二是作为遗传标记的高频率性，这样的位点在基因组中出现的频率很高，并且分布很广；三是由于重复序列两侧的特异性单拷贝可作为其在基因组中定点的标记，可采用PCR技术使操作实现自动化。由于它在基因组中分布较广，数目多，且符合孟德尔遗传规律，因而可以为连锁分析提供足够多的遗传信息，加之可利用相对容易的PCR及电泳等手段进行检测，使得这一系统成为目前在基因定位的研究中应用最多的标记系统。事实上，在人类和哺乳动物的DNA分子连锁图谱中，微卫星已成为取代RFLP的第二代分子标记而被广泛使用。 VNTR和STR的遗传学图距与常规的遗传学图距一样，是以在形成精子或卵子的减数分裂过程中，两个位点之间进行交换、重组百分率的结果。它们都以cM为单位的。 SNP标记 1996年，美国的E.S.Lander提出了第三代DNA遗传标记的单核苷酸多态性标记（Single nucleotide polymorphism, SNP）,它是目前最有发展前途的一类新型DNA标记。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同是不再以“长度”的差异作为检测手段，而直接以序列的变异作为标记。我们知道，在一个群体中，基因组内某一基因座上可以有两个或两个以上的等位基因，这是等位基因的多态性。同样，在基因组内某一特定核苷酸位置上，也可以有不同的核苷酸。基因组中单核苷酸的置换使得群体中基因组的某些位点上存在差别，如同等位基因那样可以有两种或两种以上的不同核苷酸。SNP就是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%视为点突变）。基因组中单核苷酸的缺失、插入与重复则不属于SNP。 人类基因组中理论上可以有四种方式的单核苷酸置换，因此理论上SNPs可有两种、三种、四种的多态形式。但实际上，在人类基因组中，由于三等位型和四等位型很少而几乎无法检出，所以SNPs一般为双等位型多态标记。 SNP几乎遍布人类整个基因组，平均每1000bp就有1个SNP，总数可达300万个，这意味着每个碱基都有0.1%的杂合可能性。 虽然SNP既能在编码序列中也能在非编码序列中出现，但基因组内不同位点的杂合性存在差异。基因的编码序列由于存在选择压力，杂合的可能性要小一些。就整个基因组而言，两个不同个体之间约有几百万个碱基的差别，这相当于在蛋白组中约有10万个氨基酸的差异。 SNP标记的检测技术 理论上如何用于单碱基突变检测的技术都可用于SNP标记的检测，如RFLP、DNA序列分析等。但这些检测技术都要进行电泳，因此费时且效率不高。随着DNA芯片技术的发展，使得这一类标记的检测效率大大提高，因此很有发展前途。 DNA 芯片(DNA Chip)技术的原理 在一片小硅片上进行微阵列分析，芯片上铺有密集的具有特定碱基序列的探针，提取待测目标DNA后，切成长短不一的片断，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA与探针杂交的程度与荧