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产品中大肠埃希菌的检测 1 实验目的： 检测产品中的大肠埃希菌 2 实验步骤 2.1仪器 恒温培养箱（30－35℃）、生化培养箱（23－28℃）、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱（250－300℃）、电冰箱、366nm 紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。 锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。 无菌氯化钠溶液、无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、无菌聚山梨酯80、大肠埃希菌、靛基质、接种环、结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染液 培养基：营养肉汤、营养琼脂、胆盐乳糖（BL）培养基、MUG培养基、EMB 2.1.1 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解至1000mL，121℃灭菌20min。 2.1.2 pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微温溶解，分装，过滤，灭菌。 2.1.3 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液：取吐温80 1mL加0.9%氯化钠溶液至100mL，121℃灭菌20min。 2.1.4 靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛10.0g，加入戊醇150g，充分振摇，完全溶解后，取浓盐酸50mL徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。 2.1.5 沙黄染液：取沙黄0.25g，加95% 的乙醇10mL，使完全溶解后，加水至100mL。 2.1.6 结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95% 的乙醇20mL 使溶解，加1%的草酸铵溶液80mL，混匀。静置#23 使用，置密闭棕色瓶中储存。 2.1.7 碘试液：取碘化钾2.0g，加水3-5mL 溶解，加入碘片1.0g，全部溶解后，加水稀释至300mL，置密闭棕色瓶中储存。 2.1.8 营养肉汤培养基：蛋白胨10g ，牛肉浸出粉3g，，氯化钠5g，水1000mL 取上述成分，混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，灭菌。 2.1.9营养琼脂培养基的制备：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂 15-17g蒸馏水 1000mL pH 7.4 将除琼脂以外的各成分溶解于水中，以1moL/L NaOH溶液校正pH7.4，分装三角瓶，而后按培养基的量加入1.5%-1.7%琼脂，0.1Mpa灭菌20min后倒平板备用。 2.1.10 胆盐乳糖培养基（BL）：蛋白胨20g ，乳糖5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.3g，牛胆盐（或去氧胆酸钠0.25g)1.3g，水1000mL 除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热溶解后，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。 2.1.11 4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）：蛋白胨10g，氯化钙50mg，硫酸锰0.5mg，硫酸锌0.5mg，硫酸镁0.1g，氯化钠10g，磷酸二氢钾（无水KH2PO4）0.9g，磷酸氢二钠（无水Na2HPO4），亚硫酸钠40mg，去氧胆酸钠1g，4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸75mg，水1000mL 除4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸外，上述各成分溶解于1000mL水中，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，加入4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸，溶解后，每管分装5mL，115℃，灭菌20min。 2.1.12 曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）：营养琼脂培养基100mL，20%乳糖溶液5mL，曙红钠指示液2mL，亚甲蓝指示液1.3—1.6mL 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液，摇匀，倾注平皿。 2.1.13 曙红钠指示液：取曙红钠2.0g，加水溶解成100mL。 2.1.14 亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水溶解成100mL。 2.2对照用菌液的制备： 取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5mL 营养肉汤培养基内，置36℃±1℃，培养18~24h，取均匀培养物1mL用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1mL含菌10~100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。 2.3供试液的制备： 取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至1000mL，用匀浆仪（3000~5000r/min 2~4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 2.4阳性对照试验 各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养