weston blot相关试剂配方-机能实验室.docVIP

Western-Blot试剂配制 1母液 1.1 1.0mol/L Tris?HCl Tris (MW121.14) 30.29g、蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH 7.4 7.5 7.6 8.0 HCl 约17ml 约16m 约15ml 约10ml 1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g、异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。 1.3 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 1.4 0.2mol/L Na2HPO4 Na2HPO ?12H2O（MW 358.1471.6g，蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。 1.5 10％SDS SDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 1.6 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 （可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可） 1.7 1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。 1.8 0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。 1.9 40％Acr/Bic（37.5:1） 丙稀酰胺（Acr）37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至 100ml 溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 1.10 30％Acr/Bic（29:1） 丙稀酰胺（Acr）29g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至 100ml 溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 1.11 20％Tween20 Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4℃保存。 2 使用液配制 2.1 单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris?HCl（pH8.0）2.5mlNaCl 0.438g ，TritonX-100 0.5ml，蒸馏水至50m混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方： 50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。 RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。 2.2 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81ml，NaCl 17g，蒸馏水至 2000ml 2.3 G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇 50ml磷酸 100ml蒸馏水至 1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。 2.4 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44）0.877g蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。 2.5 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml，溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0