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ABI 3500xL基因分析仪操作流程标准测序反应质粒测序标准实验流程1．对质粒DNA的质量和浓度要求 纯度：OD 260/OD 280= 1.6~2.0，用量：每反应150~300 ng。2．测序 PCR 反应 标准反应体系：3．测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化。（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。（4）取10 μL Hi-Di Formamide加入96孔板中，再加入10 μL待测样品，振荡混匀离心。PCR 产物测序标准实验流程对PCR 产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100 ng。强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。PCR产物的测序 PCR 反应标准反应体系：测序产物纯化：方法同上。上机测序（一）启动系统打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。打开3500 xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。启动电脑桌面Data collection software。检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。（二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3. 按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。（三）创建平板1. 点击Create Plate From Template，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer。一般详细如下。点击屏幕下方的Assign Plate Contents。输入各个孔的样品名称等信息，Results group：输入结果的保存路径。选中下面控制面板上Assay，Filename convention，Results group三个项目。点击Link Plate for Run→OK。检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击Start Run，即启动运行。（四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看Instrument Run Views and Flags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。启动、暂停或继续运行。（五）查看结果点击Review Results即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。分析测序结果打开软件：双击电脑桌面Sequencing Analysis v5.4图标。导入结果：点击工具栏中Add samples 按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。分析：Sample manager中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列)。选中BC复选框，点击工具栏中Start analysis 按钮，即开始分析。分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。点击工具栏中Analysis report 按钮，可查看结果状态(BC status)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。sequence显示碱基序列及其QV评分结果。注意：a. 蓝色：High QV = 20+，结果可信；黄色Medium QV = 15 to 19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色Low QV≤15，结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。Electropherogram显示电泳峰图及序列。Raw显示看到原始电泳图。打印：Sample manager中选中P (print)复选框，点击Start analysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。操作注意事项测序反应：（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。（2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠。（