差异表达基因的几种筛选方法.pdfVIP

286 第四军医大学学报( J Fourth M ilMedU iv) 2007, 28( 3) http: / /jour al. mf mu. edu. c # 综述# : 100022790( 2007) 0320286203 胞的mRNA逆转录后进行 PCR扩增. PCR 3c端引物序列是针 对 mRNA 的 poly(A)尾设计的, 一般是 11个 T再加上两个碱 基, 这样 12 种 3c端引物 ( T11AA, T11AC, T11AG, T11AT, T11CA, T11GA, T11CC, T11CG, T11CT, T11GC, T11GG, T , T11GT)就可以与所有 mRNA 的 poly( A)尾匹配; 5c端引物是 (第四军医大学西京医院肝胆外科, 陕西 西安 710033) 随机引物, 一般为 10个碱基, 因此产生一些不同长度的 cDNA 片段, 电泳后比较两者的差别而得到差异表达基因的 cDNA. = 多种因素 致的基因差异性表达与疾病的发生发 但这个方法存在许多严重的缺陷, 它的 5c端随机引物一般常 展密切有关, 分离差异表达基因, 对于研究细胞生命过程的调 有 2~ 3个碱基不能与 cDNA模板完全匹配, 而且 PCR 反应中 节机制及致病机制具有重要意义. 20世纪 90 年代以来, 先后 随机性、偶然性比较大, 容易形成非特异性扩增而造成高的假 出现了mRNA 差异显示 PCR (mRNA DDRT2PCR)、代表性差 阳性率, 这就使下游的筛选工作很巨大. 理论上此方法可以 异分析 (RDA )、抑制性消减杂交( SSH )、基因表达连续性分析 检测到 95% 以上的转录体, 但由于引物序列的随机性和竞争 ( SAGE)和 DNA 微阵列( DNA microarray)等多种分析差别表 性模板结合位点的存在, 很难确定实际的原始 RNA 丰度. 尽 达基因的方法. 我们对以上方法的原理、基本步骤及其应用 管有上述缺陷, 但由于其实验步骤较简单, 此方法在实际工作 进行简要综述. 中应用仍较多, 例如用于筛选在肿瘤发生、愈伤过程以及胚胎 = mRNA; ; DNA 植入过程中起重要作用的基因等. = Q786 = B 2 ( rep resen tational differen ce analysis, 0 RDA) 随着各类基因组计划的相继完成, 人类面临的更艰巨的 RDA[ 4- 8]是 L isitsy 等于 l993 年在差减杂交的技术基础 任务是研究基因功能活动, 也就是说基因组序列分析仅仅代 上发展的分析基因组 DNA 差异的方法, H uba k 等于 l994 年 表了遗传信息复杂性的一个层次, 而遗传信息有序地、时相地 对其作改良后用于 cDNA 的分析. 该技术是将差减杂交与