TALEN-建立基因敲除敲入细胞系流程.pptxVIP

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2017-12-18 发布于江西
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TALEN-建立基因敲除敲入细胞系流程.pptx

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TALEN-建立基因敲除敲入细胞系流程

利用TALEN技术建立基因敲除/敲入细胞系;实验流程;确认靶基因以及靶位点;1.2 从有哪些信誉好的足球投注网站结果中选择物种，如人homo sapiens;1.3 点击打开该基因序列选择GeneBank ;1.4 在例表中寻找CDS区;1.5 在online TALEN design软件如/中输入基因序列，或打开DNA Star Seqbuilder在File文件中选择New DNA复制全部基因将其复制到其中;1.6 在全部序列中标出CDS区域 ;实验流程;TALEN的设计;TALEN设计示意图;实验流程;Day1: 根据上述设计好的TALEN识别序列，选择模块加样;Day2:获得TALEN质粒平板，挑取单克隆;Day3:过夜培养菌液取4-5ml进行质粒抽提;将左、右臂标准序列及测序结果分别输入，进行氨基酸blast比对，如下图所示：;上游引物比对结果;实验流程;一、抽提高浓度正确质粒 1、中抽TALEN正确质粒，得到高浓度高纯度的TALEN质粒 2、?电泳检测其浓度?分光光度计检测其浓度和纯???;二、转染 ;;活性检测方法①---测序鉴定 A、测序结果查看峰图;B、PCR产物连接到T载体，单克隆测序确定打靶效率;C、测序结果分析建议送30-50个克隆，将测序结果与目标基因的原始系列进行比对，计算突变率。;活性检测方法②—酶切鉴定法;活性检测方法③ T7E1assay;实验流程;药筛预试验;96孔板单细胞培养;Knock-in 载体构建;打靶示意图（缺失）;打靶示意图（点突变）;打靶示意图（基因过表达）;利用TALEN建立KO细胞系----实例分析;脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天;大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）;2015-3-4;打靶效率经验参考;打靶效率经验参考;SIDANSAI Biotechnology CO.,LTD