脑胶质瘤IDH2基因突变HRM检测方法的初步建立-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１２）：５７６３ 脑胶质瘤ＩＤＨ２基因突变ＨＲＭ检测方法的初步建立 １ １ １ ２ １ ２ ２ 王银辉 　张海燕 　杨传红 　张　伟 　赖晃文 　陈晓东 　王　捷 （１广州军区广州总医院 医学实验科　广州　５１００１０　２广州军区广州总医院病理科　广州　５１００１０） 摘要　异柠檬酸脱氢酶２（ＩＤＨ２）基因突变常常发生于ＷＨＯ  级的星形细胞瘤，少突胶质细胞 ⅡⅢ 瘤，和大部分继发性胶质母细胞瘤中。在临床上，ＩＤＨ２突变已经显示对胶质瘤患者有诊断和预 后意义。拟通过提取胶质瘤石蜡包埋组织ＤＮＡ，优化ＰＣＲ反应条件，初步建立ＩＤＨ２基因突变高 分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇ，ＨＲＭ）检测方法。并与直接测序法对比，观察反应体系 的检测灵敏度和稳定性。响应面分析结果证明２０ｌＨＲＭ反应体系中，引物浓度０．６ｍｏｌ／Ｌ，模 μ μ ２＋ 板量４５ｎｇ，Ｍｇ 浓度２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ，退火温度５２．５℃为最佳。ＨＲＭ检测 ＩＤＨ２基因突变的结果和 直接测序法一致，但灵敏度更高。表明所建立ＨＲＭ方法简单，特异性强，准确可靠，可为ＩＤＨ２突 变检测的临床应用提供借鉴和依据。 关键词　ＩＤＨ２突变　胶质瘤检测　高分辨率熔解曲线分析 中图分类号　Ｒ７３９ 　　异柠檬酸脱氢酶（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ＩＤＨ２基 没有检测 ＩＤＨ２突变的抗体，因此不能用免疫组化和 因在临床研究中具有重要的意义，ＩＤＨ２基因定位于 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ的方法进行检测。目前检测ＩＤＨ２突变 １５ｑ２６．１，编码的异柠檬酸脱氢酶存在于线粒体中，参 主要是通过ＰＣＲＳＳＣＰ、ＤＮＡ直接测序、焦磷酸测序、限 与ＴＣＡ循环，催化异柠檬酸生成 酮戊二酸，与细胞 制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）等。这些方法均有其缺 α 缺氧诱导因子（ＨＩＦ）稳定性相关，当ＩＤＨ２发生突变时 点：ＤＮＡ直接测序虽然是突变检测的“金标准”，但敏 会间接刺激ＨＩＦ１通路的激活，从而诱导葡萄糖载体 感性较低，要求突变等位基因频率在２５％以上，难以进 α １，血管内皮生长因子，磷酸甘油酸酯激酶等的表达上 行高通量检测；ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ方法繁琐、需要 ＰＣＲ后 ［１５］ ［１２］ 调，最终引起胶质瘤的发生 。ＩＤＨ２突变发生于 电泳 ；焦磷酸测序仪器昂贵。ＨＲＭ技术不受碱基位 Ｒ１７２位，导致精氨酸被甲硫氨酸代替，ＩＤＨ２在 ＷＨＯ 点与类型局限，任何突变类型都能检测到，具有高特异 ［６］ ［１３１５］  级胶质瘤和继发胶质母细胞瘤中突变率较高 ， ⅡⅢ 性、高敏感性、高通量及价格低的优点 。目前还没 此后，已有文献报道在继发性胶质母细胞瘤，低级别弥 有过关于ＩＤＨ２基因方法建立的研究报道，本研究通过 漫性胶质瘤，间变性星形细胞瘤中有ＩＤＨ２基因突变的 大量的优化实验、对比实验、稳定性评估以初步建立 ［７８］ 患者有良好的预后效果 。因此通过检测 ＩＤＨ２突 ＩＤＨ２基因ＨＲＭ方法，为临床工作提供借鉴。 变，可以对胶质瘤患者的手术、放化疗反应及预后作出 ［９１０］