第8章 植物细胞培养及次生代谢物质生产.pptVIP

表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较 实验室小规模培养： 可用摇瓶、平板、微室或看护培养法培养。 2. 大规模培养： 间歇培养；连续培养（恒化培养）和固定化培养。培养反应器可分为通气搅拌式、鼓泡式、气升式等。 8.1 植物的单细胞培养 一、外植体的选择 （一）用于直接分离细胞的外植体的选择 选择细胞之间粘结程度较少的植物组织、器官。 叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。 1965年Ball首次从花生成熟叶片中分离了离体细胞。 二、外植体的预处理 （一）消毒处理 （二）外植体的其它处理 1、预培养 可以减轻醌类物质等其他有害物质对培养物的毒害作用。 天刺黑莓茎尖培养，接种后1-2后转入新培养基，褐变现象基本不发生。 正常培养几种生长的草莓试管苗幼叶，酶解仅能产生少量原生质体，如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中预培养2～3周，则原生质产量和活力均大大提高。 2、黑暗处理 黑暗处理对外植体愈伤组织诱导率有很大影响。 一般来说叶片和茎段等随着黑暗时间延长，愈伤组织的诱导率升高。 如叶片黑暗处理21天、35天诱导率达到91.7%和100%。但处理时间过长，反而诱导率下降。 3、萎焉处理 将离体叶片置于日光或灯光下处理2~3h，易于撕下表皮，有利于进行酶解处理。 4、抗氧化剂处理 在植物组织培养中，常常会发生褐变的现象，，抗氧化剂可以抑制酚类氧化剂，减轻褐变发生。 5、高渗透压预处理 在分离原生质体前对材料进行高渗透压处理，能改善材料的生理状态，，提高原生质体的产率和存活率。 落叶果树叶片现在含13％甘露醇的无机盐溶液中浸泡1h，原生质产率大大提高。 三、单细胞的分离 机械捣碎法： 1、叶片消毒 2、把叶片切成小于1cm2的小块 3、将切成的小块1.5g放入玻璃匀浆器中，用10ml液体培养基制成匀浆。 4、将制成的匀浆通过两个无菌金属滤器过滤，滤器的孔径分别是61μm和38μm 5、通过低速离心将滤液中的细微碎屑除掉。离心时，游离细胞会沉在底层，弃去上清液，把细胞悬浮在一定容积的培养基中 6、将细胞植板置于固体培养基或在液体培养基中培养。 1、消毒叶片 2、用无菌水洗净叶片，用消毒过的镊子撕去下表皮。 3、用消毒过的解剖刀将叶片切成4 cm2的小块。 4、取切好的叶片2g置于100ml三角瓶中，瓶中预先装有20ml无菌酶液 5、真空抽气，使酶液渗入叶片。 6、将三角瓶置于往复式摇床上，，120次/min,温度25℃，时间2h 7、摇动期间，每30min更换酶液一次，将第一次更换的酶液弃去，第二次酶液中主要含有海绵薄壁细胞，第三和第四次酶液主要含栅栏细胞。 8、分别收集细胞，用培养基洗2次后培养 四、植物单细胞培养方法 1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； 2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素 ； 3细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm一400Pm的团块，悬浮培养较难； 4培养时需供氧，培养液粘度大，能耐受湿力通风搅拌： 5具有群体效应、无锚地依赖性及接触抑制性； 6 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低； 7细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度； 8 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000~50000个/ML）。 由于植物细胞具有群体生长特性，单细胞往往难以生长、繁殖。因此培养时往往需要采取特殊措施。 根据培养基分：固体培养和液体培养 液体培养又分为:液体薄层静止培养和液体悬浮培养 固体培养是指细胞在含有琼脂的固体培养基上生长繁殖的培养过程。 液体薄层静止培养是将接种有单细胞的少量液体培养基置于培养皿中，形成一层薄层，在静止条件下进行培养，是细胞生长繁殖的培养过程。 液体悬浮培养是指细胞悬浮在液体培养基中进行培养的过程。 根据培养方式分为： 看护培养法（nurse cultivation method）、 平板培养法（plate cultivation method）、 微室培养法（microchamber cultivation method）。 看护培养： 该法是把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织（也称看护愈伤组织，nurse calli）上培养。 （1）在培养容器中配制好适宜于愈伤组织继代培养的固体培养基； （2）将生长活跃的愈伤组织块植入固体培养基的中间部位； （3）在愈伤组织块的上方放置一片1cm2左右的无菌滤纸，滤纸下方紧贴培养基和愈伤组织块； （4）取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方； （5）置于培养箱中，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续的分裂和增殖，形成细胞团