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实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 ——高锰酸钾滴定法 一、实验目的 1.掌握过氧化氢酶活力测定的方法 2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 3.掌握测定酶米氏常数的基本原理和方法 二、实验原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，铁起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 总反应式：2 H2O2 2H2O+O2 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。 本次实验酶促反应速度用单位时间底物的减少量表示，求出单位时间内反应前后H2O2的量，计算出酶促反应速度。 在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。 5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 底物浓度对酶促反应速度的影响 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。 底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加迅速增加；随着底物浓度继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到极限值（Vmax）。 米氏方程表示底物浓度 与反应速度的关系 米氏常数Km Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。 Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。 米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法 （LineweaveR-Burk法）如下： [S]为底物浓度（mol/L） v为反应速度（μmol/L*min） vmax为最大反应速度（μmol/L*min） Km为米氏常数（mol/L） 用双倒数法（以1/v对1/[S]作图） 计算Km和vmax 三、材料、试剂与器具 1.材料：新鲜马铃薯 2.试剂： 1）10% H2SO4 2）0.2mol/L磷酸缓冲液,pH7.8 3）0.02mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，临用前用草酸钠标定。 高锰酸钾溶液标定 取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。 离子反应方程式：2MnO4-+5C2O42-+16H+←→2Mn 2++10CO2+ 8H20 计算公式：标定的 KMnO4 C=0.2/V mol/L 4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02 mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。 5）0.1mol/L草酸钠：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 3.器具 （1）恒温水浴 （2）研钵 三角瓶（50mL×4） 酸式滴定管（10mL） 容量瓶（50mL） 四、实验步骤 （一）酶液提取 取新鲜马铃薯5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至50mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 （二）酶活力的测定 1.反应 取50mL三角瓶4个（两个测定＋两个对照），测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加入煮死酶液2.5mL，再