陈华伟-蛋白样品制备、定量及WB.pptVIP

* Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 蛋白样品制备、定量及Western blot Brand Dep. 陈华伟 * 主要内容 蛋白样本制备 1 2 3 6 4 5 蛋白提取产品选择指南 蛋白定量方法的选择 成功Western Blot的实验方案 Western Blot简介与流程 案例分析—细胞总蛋白的提取 蛋白样本制备成功蛋白分析的基础 * 制 备 原 则 方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性 尽量抽提完全 应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 尽量去除起干扰作用的高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 蛋白样本制备的策略 * 案例分析-- 细胞中总蛋白的制备 * 高速离心收集上清即得全蛋白样本 细胞加入裂解液 冰上放置10-15分钟 蛋白定量和SDS检测 裂解样品 离心收集 定量检测 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点 表面活性剂 缓冲液 蛋白酶抑制剂 磷酸酶抑制剂 其它：H2O、NaCl、等 还原剂 RIPA Buffer 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质。 Tris-HCl（pH7.5)，提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基乙醇等。 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。 抑制蛋白酶活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入。 全蛋白抽提时注意事项 * 可以适量加入甘油,稳定蛋白 注意事项 可以适量加入核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度 抑制蛋白酶及磷酸酶 使用的表面活性剂的种类、纯度、浓度、干扰、去除等因素 试剂和器皿冰上预冷,低温4℃操作 细胞或组织的样本量 裂解液的用量 蛋白提取产品选择指南 * 蛋白提取 变性蛋白提取 活性蛋白提取 细胞结构蛋白 亚细胞结构蛋白提取试剂盒(BSP073) 蛋白质分部提取试剂盒(BSP075) 膜蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(BSP002) 胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒(BSP051) 细胞核蛋白质提取试剂盒(BSP009) 膜蛋白提取试剂盒(BSP049) 膜蛋白，核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒(BSP005) 细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒(BSP001) 一步法酵母活性蛋白提取试剂盒(BSP026) 一步法细菌活性蛋白提取试剂盒(BSP023) 一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒(BSP020) 一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒(BSP022) 一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒(BSP006) 一步法植物活性蛋白质提取试剂盒(BSP004) 石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒(BSP058) 细菌细胞蛋白裂解液(PL003) 酵母蛋白提取试剂盒(BSP013) 动物细胞蛋白裂解液(PL001) 植物蛋白提取试剂盒(BSP053) 植物 组织蛋白裂解液(PL028) 细菌 包涵体蛋白提取试剂盒(BS686) 其它 酵母 动物 动物细胞 昆虫 酵母 植物 动物组织 动物全蛋白蛋白提取试剂盒 RIPA裂解液 、 Western及IP裂解液 细菌 细菌活性化蛋白制备裂解液（PL020） 采用特殊的酶体系及温和的去污剂，样品快速充分破裂，释放蛋白质。 内含强性蛋白酶抑制剂，保证蛋白完整和最大限度保持体内蛋白的活性。 适用广泛：天然总蛋白、重组可溶性蛋白 * 时间短：整个实验过程只需要10-30分钟左右。 提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。 提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于于1D，2D电泳，免役共沉淀，Pull down, EMSA免疫沉淀，蛋白纯化，酶活分析等实验。 一步法活性蛋白提取试剂盒 产品特点： 蛋白提取产品选择指南 * 抑制剂 蛋白酶抑制剂复合物 磷酸化酶抑制剂混合物I、II、III(PLO17/8/9) 动物细胞(PL009) 真菌和酵母(PLO26) 细菌(PL027) 样品制备 血清蛋白清除剂(BSP065) 通用型蛋白沉淀剂(BSP012) 兰色琼脂糖重力柱(BSP089) 重力型去盐柱(BSP090) 柱式血清白蛋白、 免疫球蛋白清除液(BSP064) 蛋白检测产品选择指南 * 蛋白检测 和分析 无毒型蛋白质胶快速染色试剂盒(SK3011) 高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒(BSP041) 快速银染试剂盒(BSP029S-N) 糖蛋白凝胶染色试剂盒(BSP035) 超敏可逆印迹膜染色试剂盒I、II(BSP024/25) PAGE胶蛋白微量回收试剂盒(BSP025