LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达.pdfVIP

中国骨伤 2013年 10月第 26卷第 10期 ChinaJO~hopTrauma，Oct．2013，Vo1．26，No．10 · 841· · 基 础 研 究 · LMP一1基因慢病毒载体构建及其在大鼠 骨髓间充质干细胞的表达 侯慧铭，向川 ，郭丽，张桦栋 (山西医科大学第二医院骨科 ，山西 太原 030001) 【摘要】 目的：构建人 LMP一1重组慢病毒栽体，体外转染大鼠骨髓间充质干细胞，检测LMP一1基因在大鼠骨髓 间充质干细胞 的表达 。方法 ：利用PCR法从 cDNA文库 中钓取 LMP一1基 因，将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体 pGC-FU-EGFP相连接 ，转化感受态大肠杆菌，筛选 出阳性克隆 pGC—FU—LMP一1一EGFP，基 因测序对其鉴定。经 293T 细胞包装后 ，收集富舍病毒颗粒 LV—LMP-1一EGFP的细胞上清，浓缩并标定滴度，RT—PCR检测并鉴定。以最佳MOI 值体外转染大鼠骨髓 间充质干细胞 ，荧光显微镜观察转染是否成功，流式细胞仪检测转染效率 ，RT—PCR和 Western blot检测转染细胞 LMP-1基 因的表达 。结果：①基 因测序及 RT-PCR检测证实携带人 LMP一1基 因的慢病毒载体构建 成功，包装后获得滴度为2x10TU／ml的LV—LMP一1一EGFP。② 以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞 ，荧光显微镜 下可见大量绿色荧光蛋 白表达 ，转染效率可达93．5％，经 RT—PCR与 Westernblot检测 ，被转染细胞 内有LMP一1基 因 表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体，可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞 ，被转染细胞可高效表达 LMP一1基 因。 【关键词】 慢病毒； LMP—l； 骨髓 问充质干细胞； 骨质疏松 DoI：10．3969d．issn．1003—0034．2013．10．012 Constructionoflentivirns vectorcontaininghumanLIM mineralizationprotein一1 (LMP—1)anditsexpressioninrat bonemesench37malstem cells HOUHui—ming，XIANGChuan，GUOLi，andzHANGHua—don昏DepartmentofOr- thopaedics，theSecondHospitalofShanxiMedic University，Taiyuna 030001，Shnax， ina ABSTRACT objective：ToconstructarecombiantlentiviursvectorofhumanLMP一1anddetecttheexpressionofLMP一1 ininfectedratbonemesenehymalstem cells．M ethods：LMP一1genefrom thecDNA librarywereextractedbyPolymerase ChainReaction(PCR)．TheLMP一1geneswereconnectedintolentiviralvectorspGC—FU—EGFPwhichwaslinearizedbyAge IenzymetoproducerecombiantlentivirnsvectorcalledaspGC—FU—LMP一1一EGFP．thenpackagedby293Tcells．Thevirus supemanteongtainingLV—LMP一1一EGFPwasharvested．concentratedandtitrated．TheratBMSCsweretransfectedwithre． combiantlentivirusLV—LMP一1一EGFPatthemostappropriateM0I．ThemRNAandproteinexpressionofLMP一1weredetected bvRT—PCRandWesteurblot．Results：(】)LV—IP一1一EGFPwasrecombinedsuccessfullyandthetiterreached2x10TU／m1． ②Theefficiencyofinfectionwas93．5％，whichwasgetafterLV—LMP—l-