Hsa-mir-634对Vero细胞增殖和凋亡的影响.pdfVIP

生堡皮肤科杂 —2—013年 11月第46卷第 l1期 ChinJDermatol，November2013．Vo1．46．No．1l 795 · 论 著 · Hsa—mir一634对 Vero细胞增殖和凋亡的影响 王颖 樊建勇 杨慧兰 摘【要】 目的 探讨 hsa—mir-634在Vero细胞中的功能与作用机制。方法 运用生物信息学方法在线 预测hsa—mir-634的潜在靶基因细胞周期蛋白D1(CyclinD1，CCND1)的结合位点，将含有 hsa-mir一634结合位 点的CCND1的3UTR片段连人psi—CHECK2载体，构建双荧光报告基因载体。通过定点突变的方法突变hsa— mir-634和CCND1的结合位点，构建双荧光报告突变基因载体。将构建的重组质粒转染293T细胞，进行双荧 光检测；将化学合成的hsa—mir-634模拟物转染Vero细胞，荧光定量 PCR和Westem 印迹法检测 hsa-mir-634 对内源性 CCND1mRNA水平和蛋白水平表达的影响，MTS法检测hsa—mir-634对 Vero细胞增殖能力的影响， 流式细胞仪检测 hsa—mir一634对 Vero细胞凋亡的影响。结果 用生物信息学方法成功预测到hsa-mir一634 与 CCND1的结合位点；测序结果显示，野生型及突变型CCND13UTR序列成功连接到psi—CHECK2报告基 因载体；双荧光检测结果显示，过表达hsa-mir一634可以抑制荧光素酶的表达。过表达hsa—mir-634后 ，其靶基 因CCND1在mRNA水平上无明显变化，但可以显著影响CCND1蛋白的表达。过表达hsa-mir一634可抑制 Vero细胞增殖 ，这种抑制作用在转染后第4天最为明显。另外 ，过表达hsa—mir-634可诱导Vero细胞的凋亡， 空 白细胞组 、阴性对照组及 hsa—mir一634过表达组晚期凋亡的比例分别为 8．03％、7．96％和 17．33％。 结论 Hsa—mir-634通过影响CCND1的表达影响Vero细胞的增殖和凋亡。 【关键词】细胞周期蛋白D1；Vero细胞；细胞凋亡；细胞增殖；疱疹病毒2型，人；Hsa—mir-634 EffectsofmicroRNA hsa-mir-634ontheproliferationandapoptosisofVerocells ⅣG Ying, Ⅳ n— yong, ⅣGHui-lan．DepartmentofDermatology,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand, Guangzhou51ODJD．China 【Abstract】 0bjective ToinvestigatethefunotionandpossibleactionmechanismsofmicroRNAhsa．mir- 634 in Verocells．M ehtods Thebindingsitesforhsa．mir-634 intlle3UTR ofcyclinD1 (CCND1)were predicatedbybioinformaticsmethods．Then．the3UTR sequenceofCCND1containingthebindingsitesofrhsa— mir一634 wasamplifiedbyPCR．Site—directedmutagenesiswasused tocreatemutationsinthebindingsites．The wild and mutant3 UTR sequencesoftheCCNDlgenewereligated into thepsi．CHECK2 vectorseparately to constructdual—lucifeursereportervectors．includingCHECK2．CCND1wild．CHECK2．CCND1rout1，CHECK2一 CCND1mut2andCHECK2一CCND1mut3．Then．293Tcellsweretransfectedwiththefourconsturctedplasmids． and luciferaseactivitywasmeasu