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免疫组化染色技术 ; 概 述 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。 ;主要内容 一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、IHC的非特异性染色 五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制;一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。;2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前 处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度， 应设置何种对照。;二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。; 二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯Ⅲ10min，无水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水冲洗。;三、内源性酶的消除方法(一)内源性过氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%～3%H2O2甲醇液20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30min;5.DAB-H2O2溶液中加0.005M NaN3 过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min， 经洗后1％硼酸钠处理10min。 7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸30～60min。;(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min 2. 0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min;(三)内源性生物素的消除方法 1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素 2.先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。;四、IHC的非特异性染色 1.特异性抗体不纯 2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。 3.IgG的交叉反应;4.共同抗原决定簇5.单一决定簇抗体的异质性6.特异性抗原弥散7.IgG受体干扰8.鼠源性抗体检测鼠源性组织;9.内源性抗生物素蛋白结合物 内源性抗生物素蛋白指的是体内能够与抗生物素蛋白结合的分子或基团，在体内含有这种分子或基团的物质主要是内源性生物素。可以用20%蛋清封闭，或用2%卵蛋白进行封闭，或不采用亲和细胞化学方法。;解决方法： 1.用正常二抗血清吸附 2.将组织用酶消化或抗原修复 3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除 4.高度稀释特异性一抗;五、酶消化和抗原修复 1.为什么要进行酶消化和抗原修复？(1)固定液的影响 自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。;目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。; 甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。(2)抗体制备的影响;2.酶消化  (1)原理： 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联;(2)蛋白酶的种类 胰蛋白酶0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。;胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.01N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。蛋白酶K 20μg/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时间37℃ 20～40min。;链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37℃ 1～4h。无花果蛋白酶 0.1%浓度，用0.2M pH7.4 PBS稀释，消化时间37℃ 30～60min。;菠萝蛋白酶 其浓度为0.4%～1％，溶在0