第17章基因工程-生物化学.ppt

第十七章 基因重组和基因工程原理 ;第一节 基因工程概述 ;转化作用 (transformation);自然界的DNA重组;细菌的接合作用;转导作用;基因工程的目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;克隆(clone) 一个亲本细胞通过无性繁殖获得的相同子代的集合称为克隆 （clone）。获取同一拷贝的过程也称为克隆 (cloning) 。;二 基因工程原理简图;载体（vector）;载体应具备的基本特点;1. 质粒载体;;;λ噬菌体DNA改造系统 柯斯质粒(cosmid)载体，容量较大，与包装蛋白配合使用，转化效率高。 ;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;三、基因工程中重要的工具酶 ;P;限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类内切酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;基因工程中常用的工具酶及其作用;基本过程;一，目的基因的获取;1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 2. 平末端连接 3. 同聚物加尾法 4. 接头连接法 ;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（双酶切）的连接;导入方式 转化 (transformation)：用于质粒载体，化学法、电击法。 感染 (infection)：用于病毒载体、噬菌体载体。;四、重组子的筛选和鉴定;(插入失活法) 抗药性标记选择; α 互补的检测 ;（二）PCR法 （三）核酸杂交筛选法 特点是高度特异性及高度灵敏性 如：菌落杂交(colony hybridization) （四）活性筛选 根据目的基因编码有特殊生化活性的蛋白质（如：某些酶类）来筛选和鉴定;表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化;1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 表达载体： 选择标记、强启动子 、诱导调控序列 E.coli表达体系的优点： 技术成熟，表达量高，易调控 E.coli表达体系的不足 ： 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白;优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;第三节 基因工程应用与发展前景;基因组DNA文库 存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的 一种生物基因组的全 部DNA序列。;疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。; 重组DNA医药产品