基因工程-核酸杂交.ppt

基因工程Gene Engineering ;基因工程（gene engineering ）：又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。;第一节 工具酶 第二节 载体 第三节 分子克隆的基本步骤 第四节 基因工程的应用;限制性核酸酶内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 核酸酶S1 ;第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶 ;作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;限制性核酸内切酶的主要用途 ;DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 ;1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 ;第一节 工具酶 二、DNA聚合酶 ;Klenow片段的主要功能有： 1)补齐双链DNA的3?末端，同时可使 3?末端DNA标记同位素； 2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链； 3)DNA序列分析。 ; 一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5?→3? 聚合酶活性和依赖于聚合作用的5?→3?外切酶活性。 Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。;依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有： 1)逆转录作用； 2)核酸酶H的水解作用； 3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。;5?;分子量为60 kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3?末端-OH上。 ;(A、G、C、T)n;大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型， 分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同， 前者需NAD+，后者需ATP。 它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接 酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接 粘性末端，又能连接平末端。 ;第一节 工具酶 三、 DNA连接酶;催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基团， 其主要用途有： 1)除去DNA片段上的5?磷酸，以防自身连接。 2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前， 除去RNA或DNA上5?端的磷酸。; ;功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。;第二节 载体;常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。 载体大都经过改造，如质粒改造后携带某些选择性标记和克隆位点的遗传信息；?噬菌体改造后只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体，它不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表达外源基因。; ①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般 10Kb。 ②带有遗传筛选标记。 ③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。载体上具有多个限制酶的单一位点（即在载体其他部位无这些酶的相同位点）称为多克隆位点（multiple cloning sites，MCS） 。;能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。 （一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。;① 用于保存和扩增 2Kb目的DNA。 ② 构建cDNA文库。 ③ 目的DNA的测序。 ④ 作为核酸杂交时的探针来源。;; 复制起始点;; pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（lacZ?基因），该基因编码?-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型?-半乳糖苷酶实现基因内互补（?-互补），形成完整的?-半乳糖苷酶。 ?-半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。pUC载体的lacZ?基因中含有MCS，当外源基因插入MCS，lac ?-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无?-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的蓝白斑筛选实验）。 ;pUC18、pUC19质粒载体;噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病毒。 按其生活周期分为两种类型： 溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。 溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。;?噬菌体 野生型的?噬菌体是线性双链DNA，全长48.5Kb，其中60%（约30Kb