蛋白质通性.pptVIP

第二pH不连续，浓缩胶pH为6.7，分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3 第三是缓冲系统不连续，制备凝胶用Tris-HCI（Tris为三羟甲基氨基甲烷）缓冲液，电极缓冲液为Tris-Gly； 第四是电压梯度不连续，由于CI-和Gly-泳动速度不同，造成电压梯度不连续，正是由于这种不连续性，使盘状电泳对样品具有浓缩作用，既是浓度很低的蛋白质，也能形成一条清晰的带 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳的原理 此电泳的原理可用通电后各离子的电泳行为来理解，上槽缓冲液中的Gly的解离为: +NH3CH2COO NH2CH2COO- +H+ 可为负离子或两性离子，通电后，Gly -和蛋白质中的阴离子与CI-向阳极移动，当甘氨酸离子进入样品缓冲液和浓缩胶时，就遇到低pH（pH6.7）环境，使甘氨酸主要以两性离子存在，两性离子在电场中几乎不泳动，这样Gly+-停止向样品缓冲液和浓缩胶移动，就造成移动离子短缺，因而电流减弱，但整个电泳系统的电流必需维持恒定，因此在快离子（CI-）和慢离子（Gly+-）之间的区域电压增加，结果在CI-和Gly-间产生一个很高的局部电压梯度，在这条件下，离子的相对迁移率Gly＜蛋白质离子＜CI-，在这个局部电场中，所以阴离子蛋白质都移动迅速，浓缩胶是大孔胶，不阻碍蛋白质移动，如果蛋白质的移动超过CI-，那它的移动就会慢下来因为在有CI-的地方，并不缺少离子，没有高的电位梯度，蛋白质离子在CI-前沿的后边快速移动，在到达前沿时移动又慢下来， 第3章蛋白质的通性、纯化和表征 蛋白质的酸碱性质 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的方法 蛋白质相对分子质量的测定 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质 1、 蛋白质的两性解离 ★蛋白质可解离基团有肽链末端α-氨基和α-羧基；侧链基团；如果是结合蛋白，辅基的可解离基团。 ★蛋白质带有电荷主要是R基的基团解离。 ★蛋白质分子的可解离基团的pKa也可以通过酸碱滴定的方法来求得。天然球状蛋白的可解离基团大多数可被滴定，如果可解离基团埋藏在分子内部，则不能被滴定。当蛋白质变性以后，埋藏在分子内部的基团会暴露出来后，能被滴定。 蛋白质分子和氨基酸分子中可解离基团的pKa值比较 基团 蛋白质中可解离的pKa 氨基酸中可解离的pKa α-羧基 3.0-3.2 2.0-3.0 β-羧基 3.0-4.7 3.86 γ-羧基 4.4 4.25 咪唑基 5.6-7.0 6.0 α-氨基 7.6-8.4 9.0-10.0 ε-氨基 9.4-10.6 10.53 巯基 9.0-10.8 8.33 苯酚基 9.8-10.4 10.07 胍基 11.6-12.6 12.48 ★蛋白质分子的可解离基团的pKa与氨基酸相应基团的pKa值不完全相同，是因为蛋白质分子中可解离基团的解离受邻近电荷的影响。 2、蛋白质的等电点 Pr COOH NH3+ Pr COO- NH3+ Pr COO- NH2 +H+ +OH- +H+ +OH- 阴离子 pH＞pI 等电点 pH=pI 阳离子 pH＜pI ★蛋白质分子中含有许多可解离基团，可解离基团的解离与蛋白质所处溶液的pH有关，调节蛋白质所处溶液的pH值至蛋白质所带净电荷为0时，放在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时蛋白质所处溶液的pH是该蛋白质的等电点，用pI 表示。 ★蛋白质在等电点时所带净电荷为0，最不稳定，易借静电引力聚集而沉淀析出，可用于分离和提纯蛋白质。 几种蛋白质的等电点 蛋白质 等电点 酸性aa数 碱性aa数 碱性aa/酸性aa 胃蛋白酶 1.0 37 6 0.2 卵清蛋白 4.6 血清蛋白 4.7 82 99 1.2 胰岛素 5.3 血红蛋白 6.7 53 88 1.7 肌球蛋白 7.0 α-胰凝乳蛋白酶 8.3 α-胰凝乳蛋白酶原 9.1 核糖核酸酶 9.5 7 20 2.9 细胞色素c 10.7 溶菌酶 11.0 蛋白质的pI可在实验室测得，也与组成蛋白质的氨基酸种类有关。胃蛋白酶中含酸性氨基酸多，溶菌酶中含碱性氨基酸多 可逆性沉淀：沉淀的蛋白质，内部结构基本上没发生变化，仍保持原有生物学功能，消除沉淀或降低沉淀因素后蛋白质仍会溶解在原来的溶液中。 不可逆沉淀：沉淀出的蛋白质内部结构发生了变化，失去了生物学功能，消除沉淀因素后，不会溶解 盐析法：向Pr溶液加大量高浓度中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）能使蛋白质沉淀析出. 任何物质在溶剂中的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力以及溶质分子与溶剂分子之间的