[自然科学]第二代基因组测序.pptVIP

第二代基因组测序的原理及其利用 沈雨民 2011201050 前言 新一代测序平台 第二代基因组测序的利用 第三代测序 DNA测序技术早在DNA双螺旋结构发现后不久就有报导，当时的测序的方法为降解法(sequencing by degradation，SbD)，但由于操作复杂，并没有形成规模化的应用。随后Sanger等发明了具有里程碑式的末端终止法进行测序，该技术引入了聚合酶和测序胶从此，DNA 测序走向了大规模实用化的道路。 聚合酶测序法在经过一批优秀科学家的改良，成为迄今为止应用最为广泛的测序技术。随着技术的改进和创新，聚合酶测序法在新的时代仍然焕发出勃勃生机。另外有些测序法，如连接酶测序法、焦磷酸测序法、杂交测序法等，虽然很早就已经有了报道，但是局限于当时的技术条件，并没有获得大规模的应用。人类基因组计划的实施，使分子生物学的发展真正进入了基因组学时代——第一代基因组测序. 随着一个又一个物种全基因组序列被测定，基因组学和功能基因组学的研究取得了前所未有的成就。但是，我们也清楚地看到，每一个物种全基因组的测定，往往都是以政府出面或者以大公司、大机构多部门协作的形式完成的，投入的人力物力资源非常巨大，并不是普通科研机构所能独立承担的。随着功能基因组学研究的不断深入，研究热点已经从宏观共性逐步深入到微观个性差异的研究，所涉及的科研问题越来越具有材料和环境的特殊性，一个物种仅仅依靠一个或几个全基因组序列进行微观个性的分析已经不能满足新时期科研的要求。要在具体个性材料上作深入地研究，迫切地需要获得多个全面、具体的基因组息，但是这个需求，对于绝大多数科学家来说，似乎仅仅是一个梦想。 科学家们开始在新时期新要求下对过去的测序技术在进行了思考，值得庆幸的是，包括聚合酶测序法和过去并没有取得规模化应用的测序技术，在这一时期都得以发展并又发明了一些新方法对原有技术的改造和新技术的发明，促使了新一代测序(next generation sequencing ，NGS)理念和测序仪的诞生，基因组学和功能基因组学进入了一个低成本、大规模、高通量测序的时代。萦绕在科学家脑海里的梦想，正逐步变成现实。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next?generation?sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep?sequencing)。 一、基本原理 新一代测序技术的核心思想是边合成(或连接)边测序。即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。基于边合成边测序的思想，在Sanger等测序法的基础上，通过技术创新，将4种不同的dNTP标记上不同的荧光，利用DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就释放出不同的荧光，根据捕获荧光信号，并转化为测序峰值，从而获得待测片段的序列信息。目前商业化应用的新一代测序仪Solexa平台就是根据这一原理设计制造的。技术的不断进步，使得单分子测序技术也从梦想逐步走向了现实，新近报道的HeliScope Sequencer就是其中的典型代表(Harris et a1．，2008)。 Whiteley等(1984)提出了利用连接酶进行测序的方法，经二十多年地改进，目前，利用连接酶进行边连接边测序的高通量测序平台已经成熟，其代表就是商业化应用的新一代测序仪SOLID Sequencer。该技术的基本基本原理是利用DNA连接酶在连接过程读取序列。每一轮测序反应中，加入通用引物和半简并引物，通过连接酶将半简并引物连接到新合成的DNA互补链上，通过鉴别加入的半简并引物来确认互补链上某一位置的DNA序列。 在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与待测模板配对，DNA聚合酶I的Klenow大片段就可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi ) 。释放出的焦磷酸基团经硫酸化酶催化形成等摩尔数的ATP ， 生成的ATP 和荧光素酶共同催化底物荧光素转化为氧化荧光素， 氧化荧光素发出的可见光强度与生成的ATP量成正比， 光信号经CCD 摄象机捕获， 并通过计算机软件转化为一个峰值， 经焦磷酸基团和ATP获得地每个峰值的高度与相匹配的碱基数目成正比????与此同时， ATP在双磷酸酶的催化下被游离的dNTP 降解， 光信号被淬灭， 并再生反应体系， 然后加入下一种dNTP ， 继续互补DNA 链的合成， 进入下一个循环(R