基因操作技术07.pptVIP

3.重叠延伸 Overlap extension 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链 五、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension 可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补 第七章 DNA定点诱变 site-directed mutagenesis of cloned DNA 定点诱变 随机诱变(molecular evolution) 易错PCR(erro-prone PCR) DNA重排(DNA shuffing) 体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) 交错延伸(stagger extension process，StEP) 突变方式 突变类型 单个碱基的置换 (base substitution) 简单的插入或缺失 (insertion or deletion) 系统的缺失、插入或成串碱基的置换 第一节 寡核苷酸介导的诱变oligonucleotide-mediated mutagenesis 70年代初 ?×174 DNA(ss DNA 5386bp), 当用带琥珀突变的 ss DNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象,即产生带野生型基因组的噬菌体 野生型DNA片段 突变体?×174 DNA + 退火 异源双链体 宿主编码的错配修复系统 全长的野生型基因组 可利用突变的DNA片段 将突变引入到野生型DNA中 M. Smith 1993年诺贝尔化学奖 加拿大生物化学家 1932年出生于英国，毕业于英国曼彻斯特大学，1956年移居加拿大。现任加拿大温哥哥华大不列颠哥伦比亚大学生物技术实验室主任。 1978年发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。 　　利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。 一、Kunkel 法 或称“U”法 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置 一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置 一、Kunkel 法 或称“U”法 ung- UDG酶缺陷, UDG酶[尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基 1．背景知识 E.coli (dut- / ung- ) 合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基 E.coli CJ236 dut, ung, thi, relA; pCJ105(Cmr) pCJ105 is a F’ plasmid ss DNA 制备载体 ss DNA 制备载体 单链噬菌体载体 phagemid载体 U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U Insert target DNA 转化 E.coli CJ236 M13K07感染 Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火 T4 DNA polymerase DNA ligase 2．原理 只有突变链能复制 转化E.coli MV1190 (dut+/ung+) (1) DNA polymerase T4 T7 Klenow 65% 11/13 36% 突变率 (84.6%) 3. 酶 (1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能会替换引物) 65% 11/