家蚕v型atp酶b亚基的克隆及表达特征.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 陈慧芳 等/家蚕V 型ATP 酶B 亚基的克隆及表达特征 487 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn April 25, 2016, 32(4): 487−496 DOI: 10.13345/j.cjb.150364 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved 农业生物技术 V ATP B 陈慧芳，王鑫，谢康，李懿，赵萍 400716 , , , . V ATP B . , 2016, 32(4): 487–496. Chen HF, Wang X, Xie K, et al. Gene cloning and expression characteristics of vacuolar-type ATPase subunit B in Bombyx mori. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 487–496. 摘 要: V 型ATP 酶 (Vacuolar-type ATPase) 是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP 水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外，从而维持细胞内正常的酸碱环境。V 型 ATP 酶 B 亚基 (V-ATPase B) 作为ATP 的催化位点，也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B (BmV-ATPase B) 的 功能，首先从家蚕五龄幼虫的中肠cDNA 中克隆了BmV-ATPase B 基因并构建原核表达载体进行原核表达，获 得了重组蛋白，经质谱鉴定正确后，通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体；最后分析了 该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示BmV-ATPase B 基因序列全长 1 473 bp，预测蛋白分子量55 kDa ，预测等电点5.3 。通过Western blotting 对家蚕 5 龄第3 天 和上蔟第 1 天幼虫丝腺的不同区段进行BmV-ATPase B 蛋白的表达特征分析，发现在两个时期该蛋白均在前部 丝腺高量表达，而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定 位，发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋 白进行进一步的定位，发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式，为 深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。 : 家蚕，V 型 ATP 酶 B 亚基，基因克隆，原核表达，Western blotting ，免疫荧光定位 Received: August 11, 2015; Accepted: January 19, 2016 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No.. Corresponding author: Ping Zhao. Tel: +86-23 E-mail: zhaop@ (No. 2016-02-03 /kcms/detail/11.1998.Q1100.001.html 488 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2016 Vol.32 No.4 Gene cloning and expression characteristics of vacuolar-type ATPase subunit B in Bombyx mori Huifang Chen, Xin Wang, Kang Xie, Yi Li, and Ping Zhao State Ke