紫贻贝lc3b蛋白的原核表达及抗血清制备-水产学报.pdfVIP

第41 卷 第 4 期 水 产 学 报 Vol. 41, No. 4 2017 年 4 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Apr., 2017 文章编号: 1000-0615(2017)04-0498-08 DOI: 10.11964/jfc.20160610454 紫贻贝LC3B蛋白的原核表达及抗血清制备 余振兴， 朱 倩， 姚翠鸾* (集美大学水产学院，福建 厦门 361021) 摘要：LC3B 是检测自噬程度的标志性分子，但是在低等动物体内缺少特异性强的 LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡，本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆 到pET-32a 原核表达载体中构建重组表达载体，进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进 行摸索；采用亲和层析对重组蛋白进行纯化，并采用SDS检测及Western blot进行 验证；利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔，制备其多克隆抗体。结果显示，在20 °C ， 转速为150 r/min条件下，当IPTG浓度为0.6 mmol/L ，诱导表达10 h后，可以得到高表达 量、可溶性的重组MgLC3B-His 融合蛋白，亲和层析纯化后，获得单一条带的MgLC3B-His 可溶性重组蛋白；采用纯化后的MgLC3B-His 融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫，采集 分离兔抗血清并利用protein A 纯化，获得紫贻贝的LC3B 多克隆抗体，效价为25 600 。紫 贻贝LC3B 多克隆抗体的成功制备，为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究 奠定了基础。 关键词: 紫贻贝；LC3B ；重组表达；细胞自噬；多克隆抗体 中图分类号: Q 785 ；S 917.4 文献标志码: A [6] 细胞自噬是细胞死亡的重要调控方式之 (autophagy-related genes, Atgs)共有40余个 ，根据 一。细胞通过形成自噬体降解胞内多余或者受 功能不同，可将其分为5类： Atg1亚家族(包括 损蛋白及细胞器，在调控机体的生理及病理状 Atg1 ，Atg13 ，Atg17 ，Atg29与Atg31) ，主要负责 态过程中发挥重要作用。当机体处于营养缺乏、 在自噬体形成起始位点PAS(phagophore assembly 饥饿等胁迫状态下，细胞自噬可以将机体内非 site)引发自噬体的形成；Atg9亚家族(包括Atg23 ， 基本生命活动必须的物质降解回收用来维持细 Atg27 ，Atg2与Atg18) ，负责将构成初始自噬体膜 [1] 胞生命活动 ；另外，细胞自噬还可以通过清除 的膜碎片传递给Atg1复合物；磷脂酰肌醇— 激酶 体内功能受损、老化的蛋白分子和细胞器，在