杜氏盐藻磷脂酶c基因dsplc的原核表达与纯化.pdfVIP

核 农 学 报　 ２０１６，３０（９）：１６７９～１６８３ １６７９ 　 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮｕｃｌｅａｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１０００⁃８５５１（２０１６）０９⁃１６７９⁃０５ 杜氏盐藻磷脂酶 Ｃ基因ＤｓＰＬＣ 的原核表达与纯化 刘丽颖　 柴晓杰　 丛玉婷　 武天祥　 刘艺琼 （大连海洋大学／ 农业部北方海水增养殖重点实验室／ 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁 大连　 １１６０２３） 摘　 要：为了进一步研究磷脂酶Ｃ 的生理功能，利用ＲＴ⁃ＰＣＲ技术扩增了ＤｓＰＬＣ 的开放阅读框序列，并 与质粒ｐＧＳ２１ａ连接，构建了原核表达载体ｐＧＳ２１ａ⁃ＤｓＰＬＣ。 将该重组质粒导入大肠杆菌ＢＬ２１ （ＤＥ３）感 受态细胞，经ＩＰＴＧ（异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷）诱导表达出融合蛋白。 经ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测，融合蛋 白在包涵体和上清中均存在。 可溶性蛋白经Ｈｉｓ柱纯化后进行电泳分析，结果表明，在９６ｋＤａ左右有单 一的蛋白条带，说明融合蛋白得到有效纯化。 蛋白印迹结果显示在９６ｋＤａ 左右有明显的杂交条带，初 步证明纯化的蛋白是带有Ｈｉｓ标签的磷脂酶Ｃ。 盐藻磷脂酶Ｃ 的成功表达与纯化，为深入探讨磷脂酶 Ｃ的性质及功能奠定了基础。 关键词：盐藻；磷脂酶Ｃ；原核表达；蛋白纯化；蛋白印迹 ＤＯＩ：１０１１８６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１２０１６０９．１６７９ 　 　 杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）简称盐藻，是一种光 ＤＡＧ 的水平升高，并经分析推测 ＤＡＧ 可能在 ＰＬＣ 合自养型单细胞真核绿藻，无细胞壁，原生质外仅有一 介导的信号转导中充当第二信使。 由此推断 ＰＬＣ 层由糖蛋白和神经氨酸组成的外膜。 盐藻是迄今为止 在盐藻应答盐胁迫信号传导中起重要作用。 因此， 发现的最耐盐的真核生物之一，近年来，国内外学者对 深入探讨盐藻磷脂酶 Ｃ 的生物学特性及作用机制， 盐藻耐盐分子机制的研究主要集中在盐藻适应高盐环 对阐明盐藻应答盐胁迫信号的分子途径具有重要 境的渗透调节［１－３］、耐盐相关基因的克隆［４－５］ 以及盐 科学意义。 ［６－８］ 本研究利用ＲＴ⁃ＰＣＲ技术扩增了ＰＬＣ基因ＤｓＰＬＣ， 适应蛋白 等方面，并取得了一些成果。 但到目前 为止，关于盐藻应答盐胁迫信号的分子机制尚不清楚。 构建了原核表达载体ｐＧＳ２１ａ⁃ＤｓＰＬＣ，使ＰＬＣ基因在大 磷脂酶 Ｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ，ＰＬＣ）广泛存在于真 肠杆菌中成功表达，并获得了纯度较高的融合蛋白，旨 核生物中，是肌醇磷脂信号转导途径的关键酶，能水 在为下一步制备相应的抗体、筛选ＰＬＣ 的互作蛋白、进 解磷脂酰肌醇 －４，５ －二磷酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ － 一步研究ＤｓＰＬＣ的功能及作用机制奠定基础。 ４，５ －ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＩＰ２）产生肌醇 －１，４，５ －三磷酸 （ｉｎｏｓｉｔｏｌ － １，４，５ － ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰ３）和二酰甘油 １　 材料与方法 ２＋ （ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＡＧ），分别激活 ＩＰ３／ Ｃａ 和 ＤＧ／ ［９－１３］ ［１４］ １１　 藻种 ＰＫＣ２ 个信号传递途径 。 Ｅｉｎｓｐｈａｈｒ 等 研究 表明，在渗透胁迫调节中盐藻ＰＬＣ加速催化ＰＩＰ２ 水 杜氏盐藻由大连海洋大学水生生物学重点实验室 解为ＤＡＧ和ＩＰ３。 Ｉ