环境工程微生物学-周群英-教学课件M13-08实验八.pptVIP

实验八 总大肠菌群数的测定 一、实验目的* 1. 了解大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性； 2. 学会总大肠菌群的测定方法； * 该实验是综合性实验内容之一。 二、基本原理 大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24～48h能发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。它们普遍存在于肠道中，且具有数量多、与多数肠道病原菌存活期相近、易于培养和观察等特点。该菌群包括肠道杆菌科中的埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸细菌属和克雷伯氏菌属。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。通常可根据水中大肠菌群的数量来判断水源是否被粪便所污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。 三、主要内容 1.多管发酵法（MPN法） (1)培养基的配制： a.乳糖蛋白胨培养基(供多管发酵法的复发酵用)配方（半成品或称脱水培养基）：取35g（3倍浓缩则加量配制）加热溶解至1000mL水中(烧杯),分装后灭菌(115℃,相对蒸汽压力0.072MPa）灭菌20min) 。　 b.伊红-亚甲蓝培养基(供多管发酵法的平板划线用)配方：取36g加热溶解至1000mL水中(烧杯),分装后灭菌（灭菌条件同上）。 （2）初发酵试验 a.水样:原水(10mL、1mL)、10-1 ～ 10-2浓度 b.将试管编号 c.加水样 　　在1支装有5mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨溶液的试管中，加入10mL水样（原水水样）；其余分别加1mL水样（不同浓度），送37℃培养箱培养24h，观察其产酸产气情况，若24h未产酸产气，可继续培养至48h，记下试验初发酵结果。 另2管培养基留待复发酵试验时用。 在装有5mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨溶液的试管中，加入10mL水样；在装有10mL (原配方)乳糖蛋白胨溶液的试管中，各加入1mL、以及需要稀释的水样（稀释倍数取决于水样中总大肠菌群浓度）。混匀后37℃培养24h，观察其产酸（培养液颜色由紫色变黄色）产气（倒置的杜氏小管中有气泡）情况，若24h未产酸产气，可继续培养至48h，记下试验初发酵结果。 如所有水样（试管）都没有产酸产气，可直接查检索表得出实验结果。 （3）确定性试验用平板分离： 将24h或48h培养后产酸产气或仅产酸的试管中的菌液分别划线接种于伊红-亚甲蓝琼脂平板上，于37℃培养24h，将出现以下三种特征的菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。 ① 深紫黑色，具有金属光泽； ② 紫黑色，不带或略带金属光泽； ③ 淡紫红色，中心颜色较深； ④ 淡红(粉)色。 （4）复发酵试验和结果： 选择具有上述特征的菌落，经涂片、染色和镜检后，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则用接种环挑取此菌落的一部分转接至乳糖蛋白胨培养液的试管中，于37℃培养24h后，观察试验结果，若产酸产气即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管数查检索表。 如果被测水样（或其他样品）中大肠菌群的量比较多，则水样必须稀释以后才能做，其余步骤与测自来水基本相同。可查相应的检索表得出结果。 2. 滤膜法（以自来水为例)* (1) 倒培养基：用伊红亚-甲蓝培养基倒培养基，冷却后待用。 (2) 过滤水样：用无菌镊子将灭过菌的滤膜移至过滤器中，然后加333 mL水样至滤器抽气过滤，待水样滤完后再抽气5s即可。 (3) 将滤膜转移至平板：滤膜截留细菌面向上，用无菌镊子将滤膜转移至上述已倒好的平板，使滤膜紧贴培养基表面。 * 因实验时数和设备条件的原因，滤膜法不做。 滤膜法测定总大肠菌群 (4)培养：于37℃培养箱培养22～24h。 (5)观察结果：将具有大肠菌群菌落特征、经革兰氏染色呈阴性、无芽孢的菌体（落）接种到乳糖蛋白胨培养基或乳糖蛋白胨半固体培养基（穿刺接种），经37℃培养箱培养，前者于24h产酸产气者或后者经培养6～8h后产气者，则判定为阳性。 (6)结果计算：将被判为阳性的总菌落数乘以3，即得每升水中的大肠菌群数。 四、实验材料、器皿 加压蒸汽灭菌器、培养皿、锥形瓶、烧杯、试管、量筒、药物天平、培养箱、水浴锅、移液管、铁架、表面皿、细菌过滤器、滤膜、抽滤设备、pH试纸和棉花等；牛肉膏、蛋白胨、乳糖、酵母浸膏、琼脂、质量浓度16g/L溴甲酚紫乙醇溶液、质量浓度20g/L 伊红水溶液、质量浓度6.5g/L 亚甲蓝溶液、NaCl、NaOH等。 五、注意事项 本实验穿插进行。 *