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实验四细菌淀粉酶的测定 一、实验目的 1.了解淀粉酶的作用特点; 2.掌握测定方法。 二、实验原理 淀粉酶是指一类能催化、水解淀粉分子中糖苷键的酶的总称。主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等。本实验为淀粉酶的定性测定,活性污泥混合液中的淀粉酶将淀粉水解为糊精(或其他淀粉的水解物),淀粉遇碘呈蓝色,随着蓝色逐渐消失而成为棕色反应物,这时可根据淀粉酶作用后淀粉溶液与碘反应时蓝色物消失的速度,来衡量酶活力的大小。 细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验是利用点种法判断该细菌是否产生淀粉酶。 三、实验材料、器皿 加压蒸汽灭菌器 培养皿、试管、锥形瓶、烧杯、量筒 药物天平 培养箱、水浴锅、接种环 培养基 菌种:枯草杆菌、大肠杆菌、活性污泥等 四、主要步骤 1. 活性污泥混合液中的淀粉酶活性的测定。 (1)按右侧表顺序在试管中加入各种物质。 2.细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验 (1)牛肉膏蛋白胨淀粉培养基:牛肉膏 0.3g 蛋白胨1.0g NaCl 0.5g 淀粉 0.2g 琼脂2.0g 水100mL pH 7.4~7.8 灭菌条件:121℃(相对蒸气压 0.103MPa),15~20 min。 (2)倒培养基:待上述灭过菌的培养基冷却50℃左右,倒3个平板,冷凝后使用。 (2)将上述试管中的各种溶液混合均匀,记录起始时间(加入碘液算起),当加入碘液后,4支试管中的液体全呈蓝色,蓝色褪去的时间即为终点,计算各试管褪色所需要的时间,分析说明问题(褪色时间与酶浓度之间的关系)。 注:各组可以设计不同的实验方案进行实验,例如不同的底物、温度等。 (3)点种:将上述3个平板编号,用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥点种,每个平板点3~5个点,各点分布须均匀,严格无菌操作。 点种完毕,将培养皿倒置于37℃恒温培养箱内 培养24~48小时。 (4)观察结果:取出平板,将革兰氏碘液滴加至菌体周围,观察菌体周围的现象。 如发现菌体周围有透明圈,说明该菌(或活性污泥)产生淀粉酶并扩散至周围的培养基中,将培养基中的淀粉水解成遇碘不显色的物质;如滴加碘液后菌体周围呈蓝色,则说明该菌(或活性污泥)不产生淀粉酶,培养基中的淀粉未被水解故遇碘显蓝色。 观察结果:枯草杆菌和活性污泥的淀粉酶 五、注意事项 本实验与相关实验穿插进行。 * * 4 4 4 4 革兰氏碘液/滴 4 4 4 4 淀粉溶液/滴 15 0 5 10 水/mL 0 15 10 5 活性污泥/mL 4 (对照) 3 2 1 试管编号 表13-1 活性污泥混合液中的淀粉酶活性的测定 2 1 4 3 枯草杆菌产淀粉酶 1.透明圈 2.菌体 活性污泥产淀粉酶 3.透明圈 4.菌体 大肠杆菌不产淀粉酶 加碘液前 加碘液后
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