环境工程微生物学-周群英-教学课件M13-10-实验十.pptVIP

实验十  应用API 20E细菌鉴定系统鉴定肠杆菌科和其他革兰氏阴性杆菌 传统的菌种鉴定步骤包括： ① 获得纯培养物（一般指经2～3次分离的单菌落）； ② 测定一系列必要的鉴定指标（主要为生化指标）； ③ 查找权威性的菌种鉴定手册。 其中第②项内容常被微生物学工作者视为菌种鉴定的畏途，因为除了浩大的工作量外，且对技术熟练度的要求很高，初学者较难以达到。近年来，国内外推出了多种类型的成套鉴定系统及编码鉴定方法。如法国生物-梅里埃集团的API/ATB、瑞士公司的Enterotube（肠管系统）和美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统等，从而使细菌鉴定逐步成为简易化、微量化和快速化。 一、实验目的 了解API 20E细菌鉴定系统鉴定细菌的原理，并用此法进行肠杆菌科和其他革兰氏阴性杆菌的鉴定。与细菌的分离培养实验结合起来，使实验更趋完整性。 API 20E实验条是由20个含干燥底物的小管所组成（图13-20），这些小管用细菌悬浮液接种，培养一定时间后，通过细菌的代谢作用，管内培养物产生颜色的变化，或是加入试剂后变色而观察其结果。根据说明表（反应结果）判读反应，并参照分析图索引或APILAB PLUS软件得到鉴定结果。 API 20E细菌数值鉴定系统可同时测定20项生化指标，这样就解决了第②项内容中涉及的难题。20个塑料小管，即相当于20项生化指标的测试，个别小管可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科的细菌。管内加有适量糖类等生化反应底物的干粉（有标签表明）和反应产物的显色剂。每份产品都有薄膜覆盖，外有培养盒，保证无杂菌污染。如操作步骤2所示，实验时加入待鉴定的菌液，在37℃恒温培养18～24h，观察试验条上各项反应，按生化试验项目及反应结果（某些反应需加入相应试剂后再观察结果）来判定试验结果。然后用此结果编码，查阅根据数码分类鉴定的原理编制成的编码本，或用电脑检索（其软件也是根据数码分类鉴定的原理而编制），从而判断出被鉴定细菌的结果。 三、试剂盒及其配套试剂 操作步骤1 操 作 步 骤 2 具体操作： a.菌悬液的制备 　　挑取菌苔（斜面，挑一满环）至5mL无菌水中，使配制成浓度为≥1.5×108/mL 的菌悬液，在微型混合器上混合均匀。 b.接种 　　用移液器将上述细菌菌悬液充满标有*（表13-3中管号5、10、11）管，即全满；其他管仅充满管部，即半满。 c.加石蜡油 　　测定项目中有下划线者(表13-3中管号2、3、4、6、7)，加菌悬液后用矿物油(石蜡油)覆盖。 操 作 步 骤 3 经接种的试验条培养18～24h后，在标有TDA、IND 和VP（8、9、10）的小孔中分别加入TDA、IND(JAMES) 、VP1、VP2试剂，观察各项反应的变化情况，根据API20E细菌数值鉴定系统生化试验项目及反应结果表（表13-3）或供货商提供的结果阅读及分析表，确定各项反应的结果，并作记录。 将实验结果(阳性或阴性)、数据记录于表13-4中,根据每组“1.2.4”的原则,确定编码数值后,查编码本,得出实验结果。 * * 简 介 二、基本原理 培养盒 保持潮湿环境 石蜡油(容量: 125mL) 覆盖在指定小管上方 悬浮液 (容量: 5mL) 用于调菌液 附加试剂 加进指定生化管内 API 20E 试验条 每个小孔载有干燥底物 接种管(加液器) 混匀及接种 安瓿(试管)架 分离单个菌落 挑单个菌落，尽量避免使用 高度选择性培养基 调制菌液 生理盐水 (容量: 5mL) 四、实验过程 将菌悬液接种到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL) 将试验条放进培养盒内 将 5mL无菌水放进培养盒里 将石蜡油滴加至指定的生化管(有下划线的管) ADH LDC ODC H2S URE 把培养盒盖上（防水分蒸发） 把试验条放进培养箱 内，37℃培养18～24h。 按要求将附加试剂加入指定的小管内。 API20E 试剂 18～24h后 五、观察记录生化反应结果 六、实验结果 被鉴定菌 反 应 （淡）黄色 红/橙色 橙色 红/橙色 蓝绿/蓝 黑色沉淀/细线 红/橙色 红紫色 红色 红色 黑色素溶解 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 黄色 紫色 无色 黄色 黄色 黄色 淡绿/黄 无色/微灰 黄色 黄色 淡绿/黄 无色 黑色素不溶 蓝/蓝绿