色谱分及离.pptVIP

IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用： 流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1inear gradient e1ution) 或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(step wise elution)。 但是，IEC的操作变量远多于GFC，影响分离效果的因素非常复杂。这种复杂性给目标产物的选择性高度纯化带来了机遇，同时也增加了过程设计和规模放大的难度。 小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模(包括柱体积和处理量)放大，必须实施必要的探索性实验。 二、疏水性相互作用层析原理 组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于蛋白质表面。 在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸附。 被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大。 HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。 原理图示 三、疏水性吸附剂 常用配基 苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚 修饰密度 疏水配基修饰密度一般在10~40 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。 四、 影响疏水性吸附的因素 ①离子强度及种类 除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水性吸附作用力较高。 HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。 五．疏水性相互作用层析的操作 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。 为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。 蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。 疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。 六、 HIC的特点 HIC可作为IEC的补充工具。 可直接分离盐析后的蛋白质 疏水性吸附剂种类多，选择余地大 可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力 二、 反相层析 RPC RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。 由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。 所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。 三、羟基磷灰石色谱 四、反相色谱(RPC)-疏水色谱的一种 RPC主要用于分子量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。但由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。与HIC的异同 反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面； 反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性； 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。 五、分配色谱 分配色谱法是靠溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法。 载体是惰性、没有吸附能力，能吸留较大量的固定相液体。分配柱色谱法中所用的载体主要有三类： ①硅胶 ②硅藻土 ③纤维素 六、高速逆流色谱 高速逆流色谱（High speed counter current chromatography，HSCCC）是一种无固相载体的连续液液分配色谱技术，在重力与离心力场的作用下，其固定相被保留于分离柱内，从而避免了固相载体与样品发生化学反应变性或不可逆吸附。 该技术的样品回收率高，分辨率高，既适用于微量分析也可用于大规模制备。 1 金属螯合色谱 首先要制备金属螯合介质：琼脂糖环氧活化后与亚氨二乙酸盐，HN:(CH2COO)2Me偶合，形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。 2 共价作用色谱 共价作用色层分离法是根据巯基化合物与色谱填料上二硫键之间的共价化学反应面进行的色谱分离的方法。－SH基与－S－S－能组成一组氧化-还原体