细菌的及噬菌体.pptVIP

细菌的噬菌体 一、一般性状 侵染细菌的病毒称为细菌的噬菌体，简称噬菌体。 噬菌体由核酸和蛋白质外壳构成。 噬菌体有丝状的、球状的，但大多数为蝌蚪状的。 蝌蚪状噬菌体 噬菌体的侵染 噬菌体接触到对它敏感的细菌时，它以尾部末端吸附细菌，其中DNA通过尾部注入到细菌细胞内，蛋白质外壳还留在细菌体外。注入细菌细胞内的DNA，控制和改变了细菌的代谢活动，并在其中复制噬菌体的DNA和蛋白质外壳，然后组成新的噬菌体。细菌就全部消解并释放新噬菌体。 噬菌体的侵染 噬菌体的侵染 噬菌斑 培养的细菌被侵染后就会发生明显变化，原来混浊的细菌悬浮液就会变清；在琼脂平板上的细菌就会出现无菌的透明斑，称为“噬菌斑”。 噬菌体都有一定的寄生范围，有的寄生范围广，可以侵染一个属中不同种的细菌。甚至不同属的细菌称为多价噬菌体；有的寄生范围窄，仅能侵染同一种细菌，甚至种内的一个菌系，称为单价噬菌体。 前者在研究细菌亲缘关系有作用；后者在细菌的鉴定上应用。 噬菌体的侵染范围 二、研究方法 噬菌体的分离 噬菌体的纯化 噬菌体的繁殖 噬菌体的保存 1、噬菌体的分离 噬菌体的存在与寄主细菌有关，一般从寄主细菌所在的场所可以分离获得。 植物病原细菌的噬菌体，可从感病植株的感病部位、病残体或者感病植株生长的土壤中分离获得。 在土壤中分离时，因为土壤中杂菌较多，分离的噬菌体也可能不是单价的噬菌体，这时需要进行目标菌的诱发。即把目标菌倒入土壤中，过一段时间后，再从土壤中分离噬菌体。 分离举例： 病组织提取液获得； 将病组织切碎加水研磨——滤纸过滤——滤液5ml加入试管中——加1～2ml氯仿——加塞充分摇匀——静止30～60min,待分层——用灭菌吸管取上层液作平板分离 琼脂平板分离： 提取液1～2ml和浓细菌悬浮液（109/ml）1ml 加入培养皿中混合，再加入45℃肉汁胨培养基（或其他培养基），待培养基凝固后，26～28 ℃培养，如果有噬菌体，10～12小时后，琼脂平板上即可见噬菌斑。 如果从土壤中分离，可用样本加水提取，离心；上清液1ml接种到30ml 培养液中（内接1ml浓细菌液），25 ℃过夜，离心除去细菌，氯仿处理，平板分离。 分离液中的杂菌去除 氯仿处理：滤液＋氯仿（5～20：1），摇匀，静止分层，取上清液作分离用。 离心处理：6000～8000转/分，10分钟，可除去分离物中大部分杂菌。 细菌滤器过滤：用5～6号细菌滤器过滤，此方法也会使噬菌体减少。 加热处理：噬菌体的致死温度一般高于细菌，可用55～60 ℃处理提取液，以杀死细菌而不影响噬菌体。 以上方法可以根据情况确定，有时需要几种方法配合使用。 平板分离 分离噬菌体的培养基：一般选用寄主细菌生长良好的培养基，固体和液体培养基均可； 细菌菌龄：分离所用的细菌菌龄对噬菌体的繁殖影响很大，最好用对数生长期前的细菌（一般24～48小时）； 分离方法： （1）、提取液和细菌悬浮液混合涂抹于琼脂平板表面；（2）、提取液、细菌悬浮液和45℃琼脂培养基混合。 放置：26～28 ℃培养，10～12小时后，琼脂平板上即可见噬菌斑。 2、噬菌体的纯化 从一个样本分离获得的噬菌体，可能不是同一个噬菌体，需要进一步纯化。 噬菌体的纯化和细菌的纯化相似，噬菌斑就相当于细菌的菌落，纯化的方法是选择单个噬菌斑，用挑针刺一下，洗在约1ml灭菌的0.1%蛋白胨液中，就有足够的噬菌体。（一个噬菌斑的噬菌体量很大，直径约2mm的噬菌体数量可达107～109个噬菌体）。 配成的噬菌体悬浮液，按1：10的比例用0.1%蛋白胨水稀释若干次，然后用琼脂平板法培养，即可得到纯的噬菌体。 3、噬菌体的繁殖 纯化的噬菌体，繁殖后可用于性状的测定和保存。 一般用三角瓶液体振荡培养寄主细菌，培养24～48小时后，接种一小块噬菌斑，再继续培养一段时间，待混浊的细菌悬浮液变清后，用细菌滤器过滤，除去残留的细菌，即为噬菌体悬浮液。 4、噬菌体效价测定 噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，或者每毫升含噬菌体的数量。 效价测定：将样本按1：10的比例稀释6～8次，在灭菌培养皿中加入不同倍数的稀释液，再加入浓细菌液和45℃的培养基，培养12小时，检查噬菌斑的多少（一个噬菌斑被认为是由一个噬菌体繁殖起来的）。 噬菌斑 5、细菌的鉴定 噬菌体用于鉴定之前，必须测定其寄主范围，测定时使用寄主和地理来源相近的菌株。 单价噬菌体：只能侵染原来用于分离的寄主细菌，这类噬菌体就只能用于这类细菌的鉴定、分布等方面研究。 多价噬菌体：能侵染多种细菌，往往用几个多价噬菌体组合，研究不同细菌间的亲缘关系。 鉴定方法(1)、噬菌体样本多时的测定方法 噬菌体样本较多时使用此方法。 在平板上先用涂抹棒接上目标细菌（横向涂抹），细菌生长24小时后，再纵向涂抹不同的噬菌体样本。 一个平板上可测定几个