IGEM蛋白表达操作手册.pdfVIP

目录 引物设计 2 质粒小提试剂盒简明步骤(TIANGEN) 3 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 8 三、琼脂糖核酸电泳琼脂糖核酸电泳琼脂糖核酸电泳 12 PCR 扩增产物纯化（纯化试剂盒TIANGEN ） 15 琼脂糖凝胶回收DNA （胶回收试剂盒TIANGEN ） 17 PCR 扩增产物与Pet-28 载体的双酶切与连接 21 E.coli 感受态细胞的制备与转化（化学法） 24 重组蛋白的原核诱导表达 27 SDS检测 28 大量表达 30 包涵体变性及亲和层析复性方法 31 蛋白纯化 32 WESTERN BLOT 实验方案 35 透析 41 引物设计 可遵循下列原则：（Primer 引物有哪些信誉好的足球投注网站，Oligo 6 引物评价） ①引物长度：引物的长度一般为 15-30 bp ，常用的是 18-27 bp ，太短 影响引物与模板的配对但不应大于 38 ，因为过长会导致其延伸温度 大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 ② 四种碱基随机分布，在 3’端不存在连续 3 个 G 或 C ，这样易导致 错误引发（false priming）； ③引物中 G+C 含量：通常为 40-60% ，可按下式粗略估计引物的解链 温度——Tm ＝4(G+C)+2(A+T) ，Tm 值曲线以选取 72 度附近为佳，5’ 到 3’ 的下降形状也有利于引物引发聚合反应； ④引物 3’端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第 一或第二位核苷酸，以减少由于密码子摆动产生的不配对。 ⑤引物内部：尤其在 3’端，避免存在发夹结构（Hairpin）、二聚体 （Dimer）； ⑥两引物之间：尤其在 3’端，不能互补以防出现引物二聚体（cross dimer），减少产量；两引物间最好不存在 4 个连续碱基的同源性或 互补性；引物自身不能有连续4 个碱基的互补。 ⑦引物 5’端：对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位 点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生 物素、荧光素、地高辛等。通常应在 5’端限制酶位点外再加 3-4 个保 护碱基； ⑧引物不产生 false priming ：不与模板结合位点以外的序列互补，避 免错误引发 PCR 扩增。 ⑨引物序列应该都是写成 5’--3’ 方向的 引物稀释 ①将粉末状引物，14000rpm,离心 10min,使引物聚集到管底 ②小心开启管盖，向其中加入灭菌后的水，使引物稀释到 10umol ③盖好盖后，对稀释后的引物进行涡旋震荡 5min,使引物充分溶解 ④将稀释后的引物放-20 度保存，干粉状的引物可放在室温 质粒小提试剂盒简明步骤(TIANGEN) I. 实验前准备 II. 注意事项 RNase A: 使用前将提供的所有RNase A 瞬时 质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时， 离 心 后 加 入 溶 液 P1, 使 用 后 将 溶 液 使用 2 倍的菌液体积，2 倍的溶液 P1、 o P1/RNase A 置于4 C保存。 P2、P3 ； 相同体积的 Wash Buffer 和 去蛋白液PD: 使用前请将乙醇加入去蛋白液 Elution Buffer. o PD 。 转化菌:若为-80 C 甘油冻存的菌，请先 o 溶液P2: 在低于室温时会沉淀，请于50 C左右 涂布平板培养后，再重新挑选新的单 水浴加热至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用 个菌落进行培养。 后保证Buffer B1瓶盖旋紧。 切勿直接取冻存的菌种进行培养。 III. 操作步骤