高通量药物筛选利器——HTRF,在激酶研究(kinase)中的应用.pdfVIP

HTRF 技术介绍 快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得Cisbio 的 HTRF 技术一直是药物研发领域的领先技术之一。该技术已经在知名医药公司、生物技术 公司和学术研究机构应用了10 年以上。 HTRF （均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来 检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，是研究药物靶标的理想平台。该技术结合了荧 光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光 （TRF, Time-Resolved Fluorescence）两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和 FRET 的均相实验方式融合在一起，使得HTRF 技术拥有如下优势：实验方式灵活、可靠， 并且具有更高的灵敏度、更大的通量，实验结果的假阳性率较低。虽然HTRF 也是基于 TR-FRET 的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET 产品区分开来。这些特点包 括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长 的半衰期，很大的Strokes shift （如右图所示， Eu3+ Stroke’s shift 300 nm ）；同时，镧系元素 与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所 有TR-FRET 产品使用的螯合物相比，显著增加了 稳定性 （可耐受低pH 值、金属离子、DMSO、 EDTA 等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带 来的干扰。 FRET 技术简介 FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体 和（能量）受体。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的 距离之内，可以将能量共振转移到受体上。受体受到激发，发出特定波长的发射光。 将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供 体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实 验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作 简单，而且减少了实验时间和花费。 一般地，在FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短。传统 FRET 技术的限制因素是由背景荧光引起的，其来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、 化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实 验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间 分辨荧光方法将其去除。 1 TRF 技术简介 如前所述，在生物溶液或血清中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快 速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测 方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干扰降到最低。 时间分辨荧光（TRF ）利用稀土元素中镧 系元素的独特性质。在TRF 中常用的镧系元素 是钐（Sm ）、铕（Eu）、铽（Tb ）和镝 （Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大的 Stokes shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒 到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域中 日益重要。 通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是 不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系 元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到 镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并 转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。 为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定 性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应 时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可 竞争螯合物活性基团，当与FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素 与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。 2 HTRF 技术的能量供体（Donor）和能量受体 （Acceptor ） HTRF 的供体是铕穴状化合物（Eu3+ cryptate）或 Lumi4™铽穴状化合物（Tb2+ cryptat