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第十八章 蛋白质组研究中的翻译后修饰分析 第一节 磷酸化蛋白质组研究 一 介绍 蛋白质磷酸化研究是一项大事业 在生命现象的很多关键调节机制中 蛋白质的磷酸 化是最重要的翻译后修饰 20 世纪50 年代 发现磷酸化酶a 和磷酸化酶b 原来是同一种 酶的磷酸化和脱磷酸化形式 从那时开始 生物学家开始将蛋白质的磷酸化看作是一种动 [1] 态的生物调节过程 在原核生物中磷酸化位点主要位于组氨酸 谷氨酸和天冬氨酸残基 [2] 但在真核生物中的磷酸化主要发生在丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸残基 从50 年代后的几十 年里 磷酸化蛋白质的研究一直受到生物学家的广泛重视 重大的研究成果屡见不鲜 但 [2] 是 传统的磷酸化分析依赖于放射性同位素标记 Edman 降解以及薄层层析等方法 这 些方法冗长 需要高超的实验技巧和较多的蛋白质 而且对操作者存在放射性危险[3] 20 世纪80 年代 蛋白质的分析遇到了最重要的一次技术革命 电喷雾 第一种可 以运用于生物大分子的质谱电离方式诞生了 随后 基质辅助激光解析电离也运用于蛋白 质的分析 质谱分析成为蛋白质分析领域的中坚力量 当然的 作为蛋白质分析新宠的质 谱技术 也被大量的应用于磷酸化蛋白质的检测 90 年代后 质谱技术的发展迎来了历史上最好的阶段 世界各个工业科技强国投入大 量精力 开发质谱技术 各种类型的质谱纷纷出现 如MALDI-TOF MALDI-QTOF MALDI-TOF-TOF MALDI-ION-TRAP ESI-ION-TRAP ESI-Q-TOF 三级四级杆质谱和 即将成为质谱技术先锋的FTICR 本文将就使用现代质谱技术对真核生物蛋白质磷酸化的 分析检测及磷酸化蛋白质组研究的策略进行综述 ( 一) 概况 蛋白质磷酸化在真核生物中是非常重要 而且是非常普遍的现象 据估计 在任一给 [4] 定时刻 细胞内约有三分之一的蛋白质存在磷酸化 在真核生物常见的三种磷酸化形式 [5] 中 丝氨酸磷酸化最多 苏氨酸磷酸化其次 而酪氨酸磷酸化最少 三者的比例是 1800 200 1 磷酸化对于蛋白质而言是非均一性的 大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点 [6] 但这并不意味着某一蛋白质分子的所有潜在的磷酸化位点都是磷酸化的 人类的基因组 中有2% 的序列用来编码磷酸化蛋白质 主要是蛋白质激酶和磷酸酯酶 其中丝氨酸和苏 氨酸激酶的数量是酪氨酸激酶的四倍 而它们的磷酸酯酶的数量基本相同[3] 想要对蛋白质磷酸化进行分析 首先要对蛋白质磷酸化的化学有所了解 丝氨酸和苏 氨酸磷酸化是不稳定的 在碱性条件下 磷酸基团会脱去 发生 消除( 图18.1) 酪氨酸 的磷酸化由于磷酸基团连在苯环上 不会发生 消除 相对是较稳定的 丝氨酸和苏氨酸 残基上磷酸基团脱去后的质量变化与酪氨酸是不同的( 图18.2) 酪氨酸因为无法进行 消 除反应 所以在质量变化上比丝氨酸和苏氨酸少一步 质量的减少是80Da 而不是98Da 这些细节的质量变化是磷酸化质谱检测中所必须注意的 分析蛋白质磷酸化是困难的 尽管现代质谱技术的发展非常迅猛 但是磷酸化面临的 难点仍然存在 详细分析起来 难点如下 首先 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相 对较低丰度的 第二 即使我们找到一种磷酸化蛋白质 也不能排除有