FK506结合蛋白25及其突变体与CLIC1蛋白在真核细胞内共定位的研究.pdfVIP

UniversitatisMedicinalisAnhui2016 ·1391· 安徽医科大学学报Acta Oct；51(10) 网络出版时间：2016—8—10 ◇基础医学研究◇ FK506结合蛋白25及其突变体 与CLICl蛋白在真核细胞内共定位的研究 何薇1，耿慧武1，左恒2，阮操2，潘林鑫1，范礼斌1，刘晓颖1 摘要目的研究FK506结合蛋白25(FKBP25)野生型及 其突变体在真核细胞内的表达、定位及与胞内氯离子通道蛋 白1(CLICl)的共定位情况。方法以pcDNA3．1一FKBP25一 FKS06结合蛋白(FK506 bindingproteins，FK— FLAG为模板，分别构建以pCDGFP为载体的FKBP25野生 BP)是高度保守的分子伴侣蛋白家族，能与FK506 型及其缺失突变体FKBP25(1～42aa)、FKBP25(1～110 和雷帕霉素(RAPA)结合¨o。该家族广泛存在于真 an)、FKBP25(43～224aa)、FKBP25(43～110aa)、FKBP25 核生物中，不同生物之间FKBP的同源性很高，在生 (111—224aa)的真核表达质粒，并分别转染至HEK293T细 物进化过程中具有高度的保守性。研究旧。表明该 胞中，Westernblot法检测重组蛋白表达情况；将上述质粒分 家族成员都具有肽基脯氨酸异构酶(PPIase)活性， 别与带FLAG标签的CLICl质粒共转染至COS7细胞，激光 且该部分的氨基酸序列具有高度的保守性。FK． 共聚焦扫描显微镜下观察、分析荧光共定位情况。结果成 BP25(又称为FKBP3)蛋白分子量约为25ku，首次 功构建了pCDGFP—FKBP25基因的一系列真核表达质粒； Western blot显示：pCDGFP—FKBP25及其突变体pCDGFP— FKBP25(1～42 10 蛋白，可以与免疫抑制剂很好地结合，发挥免疫抑制 aa)、pCDGFP—FKBP25(1～lan)、pCDGFP— FKBP25(43～110 的作用旧J。前期实验通过酵母双杂交技术以CLICl aa)、pCDGFP—FKBP25(43—224aa)、pC— DGFP—FKBP25(111～224aa)均能在HEK293T细胞中有效蛋白作为诱饵，筛选人胎盘cDNA基因文库，筛选出 表达；GFP—FKBP25野生型在COS7细胞中主要分布在细胞 质中，细胞核中表达较少，而突变体在细胞质、细胞核均有表 用。该研究通过构建FKBP25野生型与突变体表达 达，而且细胞核中的表达多于野生型。共定位实验结果表 质粒并分别转染到哺乳动物细胞中，检测其表达及 明：野生型FKBP25蛋白与CLICl蛋白在细胞质内存在明显 定位情况，并了解其在哺乳动物细胞内与CLICl的 的共定位现象。其3个缺失突变体与CLICl蛋白的共定位 明显减少，而且共定位也存在区别：FKBP25一N与CLICl共定 初步的研究。 位主要于细胞核中，部分分布于细胞质；FKBP25一PC和FK— BP25．C与C