基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合的分析的发酵过程优化研究.pptVIP

基于13C稳定性同位素微观代谢和宏观代谢信息综合分析的发酵过程优化研究 A Powerful Tool in Metabolic Engineering 微观代谢流研究的重要性 其理论基础是中间代谢物的拟稳态假设和物料的质量守恒定律。它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后计算得出整个代谢网络的流量分布。 A B’ C A’ B C’ N N’ 基于化学计量学的代谢通量分析（MFA） 局限性 能量平衡分析上，全面确定与能量相关的反应非常困难 原核生物中存在大量无效循环 细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应及并行反应中的净通量 13C代谢通量分析 典型的应用是在连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用菌体蛋白原氨基酸的标记信息，对中心代谢途径通量进行计算。 对数生长期和连续培养的拟稳态过程 13C同位素标记代谢原理 衍生物 ALA M-15 M-85 F-302 细胞代谢物标记信息的测定方法 建立氨基酸与相应的中心代谢途径中间物之间的碳原子映射矩阵对应关系 由测得的氨基酸的标记丰度分布信息推算出对应的中间代谢物的碳原子标记信息 Ratio Experiment PEP from PPP pathway U OAA from PEP U OAA from glyoxylate U Pyruvate from malate U PEP from OAA U Serine from glycine U Glycine from serine U Erythrose-4-P from pentose-5-P U Pentose-5-P from glucose-6-P U Pentose-5-P from erythrose-4-P U Serine through glycolysis 1 Pyruvate through ED pathway 1 由计算得到的对应中间代谢物的碳原子标记信息，进而计算出代谢流经各个途径的反应速率通量。 细胞代谢途径通量计算 13C标记代谢技术的应用 1 发酵生产中底物（糖、前体等）消耗较大造成发酵原材料成本较高，如青霉素、头孢、环孢菌素、维生素、7-ADCA发酵等。 2 发酵生产过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。 3 发酵产物合成途径的分析，初级代谢与次级代谢启动之 间的关系，干扰素的合成，免疫抑制剂。 4 生产菌株工程菌改造的基础分析，表型与基因型之间的关系的阐明，更好地指导工程菌构建。 7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用 Fate of labeled CO2 in fatty acid biosynthesis Scenarios and calculations external feed feed by 13C1-ala feed by U-13C1-ala calculate ratios from MS 对生产菌代谢途径的变化分析。 标记底物的选择。 标记底物 模式的选择。 数据的处理及分析。 研究技术的成熟 发酵过程中非稳态代谢流分析 基于13CMFA的VB12发酵过程甜菜碱 的代谢及工艺优化 基于非稳态标记实验的CO2对VB12合成影响的研究 Flux rates Distribution of total pool (mean% ± SD) Point A Point B PEP from PP Pathway 35.9 ± 1.9 15.7 ± 1.7 SER from GLY 33.3 ± 2.6 52.0 ± 0.9 GLY from SER 81.8 ± 0.7 27.6 ± 1.5 PYR from MAL 1.5 ± 2.6 -0.8± 0.9 OAA from PYR 44.4 ± 1.9 44.8 ± 2.2 PEP from OAA 35.9 ± 1.2 19.8 ± 1.6 System for study of the CO2 on vitamin B12fermentation Fig. Effect of CO2 concentration on vitamin B12 fermentation 技术研究及应用的发展 * *