转基因小鼠制备实验.pdfVIP

转基因小鼠制备实验方法 1、 选取7~8 周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00 左右，每只小鼠腹腔注射 PMSG(10 IU)。 2、 47~48 小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母 鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00 前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30 左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2 液中。显 微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2 液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵 吸出，放入M2 液中洗涤，最后放在M16 液中放入5% CO2，37C0 培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2 液，覆盖石 蜡油，移入待注射的受精卵。DNA 在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA 缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵， 使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的 和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0 培养箱 培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管， 用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是 先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一 个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm 左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵 管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉 和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手 术后19~21 天仔鼠分娩，待仔鼠3 周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5 周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms 诱导卵细胞 成熟，用hcg 超排。) 第二节 转基因小鼠的制备 在研究心血管疾病时，主要运用显微注射法、基因打靶或基因剔除等方法制备各 TG M 模型 1．显微注射法 Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和SV40 DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法 导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有 种外源DNA 顺序的TGM 。1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超级巨鼠” （supermouse ）曾引起整 生物学界的轰动。这 方法 外源DNA 整合率高、容量 ，DNA 长到50kb 仍然有效，实验周期缩短，因而应用较广泛， 是制备TGM 的一种常用方法。 这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育 的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作 受精卵转基因后的养母； ⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素 （HCG）促使超排卵。处理 后与可育雄鼠交配。次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的 基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠 的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取 DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（fou nder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有5 0%机率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠 内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。 表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫 吸附试验（ELISA）或放射免疫测定（RIA）等。亦可取胚胎进行分析。显微注射法简化的 实验过程如图23-2 所示。我国已有少 实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用 此法进行载脂蛋白TGM 研究。 图23-2 显微注射法制备转基因小鼠的程序 2 ．基因打靶与基因剔除技术