12第十二课特异性抗体制备技术.pptVIP

第九章 特异性抗体制备技术 有关概念 免疫原：指用于接种动物，使之产生抗体的抗原。 第一抗体：用已知的免疫原接种于人或动物，机体会产生与之相应的、存在于血清中的抗体，这种抗体在实验中常称为第一抗体（简称一抗 Ab1）。 第二抗体：由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig接种动物或将动物Ig接种异种动物可制备出抗抗体，又称第二抗体(简称二抗 Ab2）。 抗血清：用免疫接种方法制备的含抗体血清习惯上称为抗血清（antiserum）也称免疫血清。 例如：Ag →家兔→Ab1 家兔全血清（含Ab1） →绵羊→羊抗兔Ig（Ab2） Ag---Ab1---Ab2---Ab1 3.凝胶层析法： 原理：利用分子筛作用对蛋白质进行分离。 4.离子交换层析法： 原理：利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白等电点不同，所带电荷量不同，与纤维素结合能力有差别。梯度洗脱，逐步增加洗脱液离子强度。 5.亲和层析法： 原理：是利用生物大分子的生物特异性，即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。如：抗原和抗体、激素和受体、IgG和SPA 优点是：纯度高、简单快捷、成本贵。 * * * * 纯的理想的抗原 免疫 动物 获得 高 效价、高特异性、高亲和力的抗体 纯化和检测 第一节 免疫原的制备 一.细胞性抗原制备 1.绵羊红细胞的制备: 制备程序:绵羊颈静脉采血抗凝 弃上清液 无菌生理盐水洗3次 弃去上清液 用 0.9% NaCl配成实验室所需浓度供使用。 （2——5%） 2000r/min 5分 每次2000r/min 10分 注意：红细胞洗涤次数不宜过多，以3次为宜，否则红细胞脆性增加，影响试验结果。如果用于制备溶血素的红细胞，应 注意无菌操作。 2.细菌细胞抗原的制备: 制备程序:选择标准菌种 在适宜条件下培养增殖 以无菌生理盐水刮取洗下菌苔 革兰染色镜检，验证无杂菌 以无菌生理盐水稀释至所需浓度 加温杀灭（100C02—2.5h） 无活菌试验合格后 以生理盐水配成8—10亿/ml 最后检查合格、封装、保存备用。 二.可溶性抗原制备及鉴定 可溶性抗原有: 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、外毒素、核酸等。 （一）组织匀浆的制备 1.制备程序：新鲜或低温保存材料 去包膜和结缔组织 用含0.5%/L NaN3的生理盐水灌洗 冷浴中洗净，剪成碎块 细胞破碎处理 组织匀浆 3000r/min10分 取上清液 3000r/min10分 使上清液澄清透明（即为提取可溶性抗原的材料）。 2.细胞破碎技术及评价: (1).酶处理法: 常用的酶：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶。 适用于: 多种微生物细胞的破碎。 优点是: 作用条件温和，内含物成分不易破坏，细胞壁破坏程度可控制。 (2).冻融法: 原理：突然冷冻，胞内形成冰晶，及胞内外容积浓度的突然改变而破坏。 方法：反复冻溶两次。 适用于: 组织细胞 (3).超声破碎法: 原理：超声波的机械振动而破坏 。 适用于: 微生物和组织细胞。 优点是: 操作简单、重复性好、节省时间。 (4).表面活性剂处理: 常用的表面活性剂有: 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型） 二乙胺十六烷基溴（阳离子型） 聚山梨酯 （非离子型) 、新洁尔灭等 原理：一定温度、PH、低离子强度条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使包膜的渗透压改变而溶解。 优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)