蛋白质偶联技术.docVIP

蛋白质交联技术 蛋白质交联是指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）一共价键的方式连接于蛋白质分子四大行，以制备人工抗原酶标抗体等。但标志交联方法首先发展于人孔抗原的制备研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质如化学药物，神经递质等与蛋白质或多糖等载体大分子物质共价结合，使其具有抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。目前经常采用的的偶联方法主要有重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法，碳化二亚胺法等。 现将我对上述方法的理解研究归结如下: 重氮法 （1） （2） 芳香族伯胺在低温（0～5℃）和强酸（盐酸或硫酸）溶液中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐的反应称为重氮化反应。若环上具有-N02或-SO3H等的芳胺可以高一些（40~60℃）温度进行重氮化反应。 在芳香重氮正离子中， 键呈线形结构， 键中的一个π 轨道与苯环上的 π 轨道形成共轭体系，电子离域，使重氮盐在低温、强酸介质中能稳定存在。 苯环上有吸电子基团的重氮盐较为稳定，这是由于强化了 与苯环的共轭， 重氮盐在弱酸、中性或碱溶液中与芳胺或酚类作用，由偶氮基(－N=N－)将两个分子偶联起来，生成偶氮化合物的反应，称为偶联反应。可合成偶氮染料。 偶联反应是亲电取代反应，重氮阳离子是弱的亲电试剂，它进攻苯环上电子出现几率密度比较大的碳原子。 重氮盐与酚在微碱性溶液中很快发生偶联反应。 这是由于： 　 带负电的氧原子比中性的羟基更能使苯环活化。 　但溶液PH10: 所以在进行偶联反应时，可考虑到多种因素，既考虑到 的活性，又要考虑到 和酚的活性，选择最适宜的反应条件，才能收到预期的效果。 戊二醛法 戊二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下： 反应机制 脂肪族醛、酮与氨、伯胺的反应可生成亚胺，也称为西佛碱（Schiff base)： 脂肪族醛、酮生成的亚胺中含的C=N双键在反应条件下不是很稳定的，它易于发生进一步的聚合反应。芳香族的醛、酮与伯胺反应生成的亚胺则比较稳定。 西佛碱是一类有机弱碱，其氮上的孤对电子的活性比较低。在有机合成中亚胺类化合物多有应用。碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。 此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳二亚胺，搅拌l～2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。 反应多数情况下可由酸(质子酸及Lewis酸)催化，其机理为加成-消除。其过程为醇或酚的氧亲核进攻酰化剂的羰基碳(可能已由酸催化作用更加极化，甚至已形成碳正离子)，由此加成到羰基上，然后消除酰化剂上的离去基团(该离去基团可能需要预先质子化)，得到酯。主要影响因素为底物的结构、酰化剂及催化剂等。与酸和酯作酰化剂相比，酸酐的酰化活性较强，而且酰化反应是不可逆的。酰化反应过程可以被酸(硫酸等质子酸以及三氟化硼等Lewis酸)和碱(主要为醋酸钠以及三乙胺等有机碱)所催化。酰化对象可以是醇，也可以是酚。其酸催化的反应机理可以是酰基正离子历程，也可以是加成-消除；碱催化的机理为加成-消除。 (1) 底物结构的影响 底物为醇或酚，亲核物种为羟基氧原子。当氧原子电子云密度降低时反应活性会降低，由此可知，与烷基醇相比酚及烯丙醇的酰化会困难一些，而难以酰化的底物就需要较强的酰化剂，比如酚的酰酸化一般要用酐或酰卤。 此外空间障碍也是一个较大的影响因素，如仲醇的反应速率低于伯醇，而叔醇在酸催化下会形成碳正离子，所以叔醇的酯化一般是单分子亲核取代(SN1)机理。 (2) 酰化剂的影响 在一定的反应条件下，羧酸、酸酐、酰卤、酯以及酰胺都可以成为酰化剂，其酰化活性顺序一般为酰卤(BrCl)酸酐酯酸酰胺，这一顺序实际上与离去基团的离去能力一致。催化剂可以是质子酸，如浓硫酸、磷酸、干燥氯化氢气体以及高氯酸等，也可以是对甲苯磺酸等有机酸。无机质子酸价廉易得；有机质子酸温和，可避免某些不稳定底物的分解或发生副反应。 还可以使用Lewis酸，如三氯化铝以及钛酸酯等，可避免某些不稳定底物的分解或发生副反应。 也可以使用强酸性离子交换树脂，以及树脂负载的Lewis酸，如强酸性离子交换树脂负载SnCl2。 如肉桂酸甲酯的合成：BF3催化的加成-消除反应(质子酸催化时双键会有反应，甚至会发生芳环上的烷基化反应)。 除质子酸、Lewis酸外，有一些化合物可以一定的方式与底物羧酸结合，并使其羰基碳更容易被亲核试剂进攻，从而达到催化目的，如DCC及其类似物。 DCC及其类似物催化羧酸和醇的酯化机理。 注：1 加