PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤脂质过氧化中作用.docVIP

PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤脂质过氧化中作用 　【摘要】 　　目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) 在老年酒精性肝损伤中的作用。方法 将60只Wistar老年大鼠随机分为5组：对照组1组、观察组4组（包括4 w组、8 w组、12 w组和16 w组）。参照相关文献，观察组各组大鼠用白酒灌胃法复制酒精性肝损伤动物模型，分别于开始造模后的第4、8、12、16周时处死各组动物，采用RTPCR法检测肝组织中PPARα的表达，并检测脂质过氧化指标(血清FFA水平、肝组织中MDA含量及SOD活力)变化，分析PPARα的表达与其他各项指标的相关性。结果 与正常组比较，观察组各组大鼠PPARα的表达受抑制，随造模时间的延长，其表达水平逐渐降低，特别是在12、16 w时更为明显（Plt;0.05,Plt;0.01）；而血清FFA水平、肝组织中MDA含量逐渐升高，肝组织中SOD活力逐渐降低。相关性分析表明，PPARα的表达与血清FFA水平、肝组织中MDA含量之间存在一定的效应关系，呈负相关，而与肝组织中SOD活力呈正相关。结论 PPARα与脂质过氧化关系密切，在老年酒精性肝损伤的发病机制中具有重要作用。 【关键词】 酒精性肝损伤；过氧化物酶体增殖物激活受体α；脂质过氧化 　　过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）属调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，活化后具有多种生物学效应〔1〕。近年来研究发现，作为PPARs的亚型之一，PPARα具有调节脂肪代谢、炎症反应、免疫功能、细胞分化等作用，与多种肝脏疾病关系密切。笔者在以往动物实验中初步证实PPARα在酒精性肝损伤中表达受抑制，其基因表达水平与NFκB（P65亚型）的表达、血清TNFα及IL6水平呈负相关，提示PPARα在酒精性肝损伤炎症反应中具有重要作用〔1〕。本实验拟采用RTPCR法观察PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤中的表达变化及其与脂质过氧化的关系，进一步探讨PPARα在酒精性肝损伤中的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物分组 　　健康老年Wistar雄性大鼠（22月龄）60只，随机分为5组：对照组1组，观察组1～4组，每组12只。观察组根据造模时间的不同分为4、8、12、16 w组。实验期间各组大鼠均予以饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。 　　1.2 动物模型建立 　　大鼠经适应性喂养1 w后，观察组参照相关文献造模〔2〕：用红星牌二锅头白酒（北京酿酒总厂生产，约为10.2 mmol/L酒精溶液），以1.5 ml/100 g体重的剂量灌胃1次/d，分别连续灌胃4、8、12、16 w。对照组以等剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃1次/d。 　　1.3 标本制备 　　各组大鼠分别于造模4、8、12、16 w末，禁食12 h，水合氯醛麻醉动物，下腔静脉采血，分离血清，用于检测血清游离脂肪酸（FFA）；并于肝右叶取部分新鲜肝组织在4℃下制成肝组织匀浆，经高速离心后取其上清液，用于检测肝组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力；另一部分经液氮速冻，-80℃冰箱保存，以提取总RNA，用于RTPCR方法检测PPARα mRNA表达情况。 　　1.4 血清FFA水平测定 　　采用比色法测定血清FFA水平，严格按照FFA测试试剂盒（南京建成生物工程公司提供）说明进行操作。 　　1.5 MDA含量、SOD活力测定 　　取制备好的肝组织匀浆，严格按照MDA、SOD测试试剂盒（南京建成生物工程公司提供）说明进行操作。 　　1.6 RTPCR 　　总RNA提取试剂盒(美国BBI公司产品)；RTPCR 试剂盒(日本TaKaRa Biotech公司产品)；PCR引物经Primer5.0软件设计，由沈阳联星生物技术有限公司合成并纯化，见表1。表1 目的基因引物序列及反应条件(略) 肝组织总RNA严格按照总RNA提取试剂盒操作说明进行提取，变性琼脂糖电泳法检测RNA的完整性，以随机引物逆转录合成cDNA，-80℃冰箱保存备用。 根据RTPCR试剂盒要求加入相应成分，构成反应体系。将反应体系放于RTPCR仪中进行扩增反应，RTPCR反应参数：94℃预变性10 s，然后94℃变性15 s，62℃退火及聚合1 min，共45个循环。在每个循环进行到62℃时进行荧光定量检测。反应完毕后，采用2%琼脂糖电泳检测产物的单一性。每组实验至少平行重复2～3次。选取2～6循环作为基线范围，值为0.8时作为阈值，得到各个RTPCR扩增反应的CT值，最后采用△△CT法计算公式得到观察组各组与正常组之间mRNA表达量的相对比值。 　　　相对含量%＝2－△△