OGDCE2及BCOADAE2二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中意义.docVIP

OGDCE2及BCOADAE2二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中意义 　作者：陈燕，娄加陶，姚定康，周晔，吴传勇，钱琤，蒋天舒，陈 波，仲人前，邓安梅 【摘要】 目的 通过重组表达抗原OGDCE2和BCOADCE2的二联体融合蛋白(B0)，并用于检测自身抗体及临床意义。方法 重组表达的融合蛋白(B0)，通过NiNTA亲和柱纯化，经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检测56份PBC患者血清，以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清为对照组。结果 56例确诊的PBC患者中，42例阳性，阳性率为75．0%。而健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体均为阴性。结论 通过用重组表达的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体，具有一定的特异性及敏感性，为临床进一步研究PBC，辅助诊断提供一些辅助参考。 【关键词】 BCOADAE2OGDCE2二联体(B0)；免疫印迹；酶联免疫吸附试验；原发性胆汁性肝硬化 原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是以进行性胆汁淤积伴有肝损伤为特点，并逐渐形成肝硬化及其并发症。其肝组织病变特征是以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，肝内小叶间胆管的慢性非化脓性破坏性胆管炎，最终发展为肝硬化甚至肝功能不全。血清线粒体抗体M2(AMAM2)诊断PBC的敏感性和特异性均超过90%~95%，为本病最突出的免疫学指标异常，也是重要的诊断手段[1]。M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2氧酸脱氢酶复合体(2OADC)的其中一些组分：侧链二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADCE2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDCE2)、2氧戊二酸脱氢酶(OGDC)[2~3]。我们通过采用重组抗原(BCOADCE2)和2氧戊二酸脱氢酶(OGDC)的复合体BO来检测M2抗体，以利于PBC的早期诊断。 　　1 材料和方法 　　1．1 标本来源 　　PBC患者组56例，为本院2004年8月—2006年6月间，经住院检查确诊的PBC患者。其中女54例，男3例，男女比例为1：18。年龄32~65岁。并且PBC的诊断符合2000年美国肝脏病学会(AASLD)推荐的诊断指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变(主要是碱性磷酸酶、γ谷胺酰转肽酶升高)且无其他原因解释；血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性， 同时AMA≥1：40[4]。 患者并行穿刺病理检查，汇管区有大量淋巴细胞、嗜酸粒细胞聚集，光镜下可见小叶结构完整，实质内可见凋亡小体形成及散在点状坏死，均符合PBC早期病理学特征。70例正常对照均为本院的健康体检者，50例其他肝病患者和自身免疫病患者48例(类风湿性关节炎15例，系统性红斑狼疮20例，强直性脊柱炎3例，自身免疫性胆管炎10例)为疾病对照组，均为本院住院患者。 　　1．2 纯化重组抗原 　　将特异性扩增OGDCE2和BCOADCE2的二联体BO cDNA定向插入高效表达载体PET28a(+)，转导入宿主菌大肠埃希菌(E．coli)．BL21，经异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导后表达，在变性条件下用带6个组氨酸的NiNTA琼脂糖纯化，获得高纯度的重组BO，方法参见文献[5]。 　　1．3 利用重组融合抗原IBT检测M2抗体 　　将重组蛋白BO经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)电泳后，转印至硝酸纤维素(NC)膜，封闭后依次加入血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG，显色剂3．3二氨基联苯胺四盐酸盐底物和H2O2，观察反应条带。同时用正常人血清作阴性对照。 　　1．4 ELISA法检测M2抗体 　　ELISA方法检测PBC患者，健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体。纯化后的重组蛋白，用碳酸盐缓冲液CBS(pH9．5)稀释后分别包被酶标板。OP为4 mg/L，4 ℃ 过夜(16 h)，吐温-20碳酸盐缓冲液洗涤3次后，加入小牛血清封闭，洗涤后依次加入待检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、显色剂3．3二氨基联苯胺和H2O2，经酶标比色仪吸光度450 nm 比色，读取吸光度值，判定值为阴性对照A值+5倍标准差。 　　15 统计学处理 　　用StlJderlts检验分析均值间差异。第2期OGDCE2和BCOADAE2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义 陈 燕，等 　　　2 结果 　　2．1 免疫印迹检测结果 　　用重组融合抗原BO经IBT检测，56例确诊的PBC阳性病人，检测出抗BO抗体阳性的为42例，阴性14例。正常对照和其他非胆汁性肝硬化患者抗BO抗体均为阴性。48例自身免疫病患者中，10位自身免疫性胆管炎患者中2例AMA阳性；但其血清中抗BO抗体均为阴性。结果见表