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NS398对肝细胞癌VEGF、MMP9表达调节 　【摘要】 目的 探讨NS398对肝细胞癌血管生成和侵袭的调节作用。方法 NS398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个作用时间点进行检测。采用RTPCR和流式细胞技术，观察NS398对人肝癌SMMC7721细胞株VEGF、MMP9表达的影响。结果 NS398对SMMC7721细胞有明显的生长抑制作用。与对照组相比，NS398能显著抑制SMMC7721细胞COX2、VEGF、MMP9基因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（Plt;0.001）。结论 NS398能显著抑制SMMC7721肝细胞癌中VEGF、MMP9 mRNA和蛋白的表达。 【关键词】 肝细胞癌 NS398 血管内皮生长因子 MMP9 　　0 引言 　　环氧合酶2（Cyclooxygenase2，COX2）不但与肿瘤血管生成有关［1］,还可通过改变肿瘤细胞的侵袭性和粘附性来抑制肿瘤生长［2］。我们以前实验表明肝细胞癌组织中COX2与VEGF、MMP9蛋白表达和肿瘤微血管密度（Microvessel density，MVD）之间呈正相关［3］，本实验研究COX2特异性抑制剂——NS398对肝癌SMMC7721细胞株VEGF、MMP9表达的影响，初步探讨NS398对肝细胞癌血管生成和侵袭的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养和药物干预方案 　　SMMC7721细胞分别用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在含5％ CO2 37℃培养箱中培养。培养液中分别含有青霉素、链霉素100U/ml。将对数生长期的细胞接种于96孔培养板，待细胞贴壁后加入NS398。NS398取0、25、50、75、100μmol/L 5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个时间点。每个实验组重复6孔。 　　1.2 主要试剂 　　NS398购自sigma公司。一抗山羊抗人COX2多克隆抗体，鼠抗人VEGF单克隆抗体，兔抗人MMP9单克隆抗体均为Santa Cruz产品， Trizol试剂（美国Gibco BRL公司）。PCR仪（美国PE公司PE9600型），流式细胞仪（美国BC公司EpicsXLⅡ型）。 　　1.3 RTPCR检测COX2、VEGF、MMP9 mRNA的表达 　　按照Trizol试剂说明书逐步提取细胞总mRNA。COX2反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。VEGF反应条件为: 94℃变性30s；63℃复性30s；72℃延伸30s。MMP9反应条件为： 94℃变性30s； 63℃复性30s； 72℃延伸30s。进行35个循环后进一步延伸72℃ 5min。COX2引物序列: 上游为5AAT GAG TAC CGA AAA TTC3’，下游为5CAT CTA GTC CGG AGC GGG AAG3’，扩增片段大小为420bp。VEGF引物序列: 上游为5TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC 3’，下游为5AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA 3’，扩增片段大小为418 bp。MMP9引物序列：上游：5TTG CCT TGC TGC TCT ACC TC3’，下游：5AAA TGC TTT CTC CGC TCT GA 3’,扩增片段大小为120bp。所有引物均由上海生工公司合成，选取βactin为内参照，取10μl PCR产物用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳成像系统观测成像情况。 　　1.4 流式细胞仪定量检测COX2、VEGF、MMP9的表达 　　采用间接免疫荧光标记方法。每份样品加入第一和第二抗体工作液各100μl。设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照，只加一抗和二抗的阳性对照。以荧光指数（FI）表示相对含量，FI=（样品蛋白表达荧光强度正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。 　　1.5 MTT法检测细胞增殖抑制情况 　　在96孔培养板中分别加入25、50、75、100μmol/L NS398，继续孵育24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4～5h，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度（A）。每组取3次实验平均值，计算细胞抑瘤率：抑瘤率＝（对照组A－实验组A）／（对照组A－空白组A）×100%。 　　1.6 统计学检验 　　应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，组间显著性检验采用析因设计方差分析，Pl