原发性肝癌患者血清p16及DAPK基因启动子甲基化探究.docVIP

原发性肝癌患者血清p16及DAPK基因启动子甲基化探究 　【摘要】 目的 研究原发性肝癌患者血清p16和DAPK基因启动子甲基化的改变状况及其临床意义。方法 运用甲基化特异性PCR技术，检测64例PLC患者血清p16基因和DAPK基因启动子甲基化，并分析与临床病理资料的关系。结果 PLC患者血清p16基因和DAPK基因甲基化检出率分别为76.6％（49/64）和40.6％（26/64），而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出p16基因和DAPK基因甲基化；p16基因和DAPK基因甲基化检出率与HBsAg、分期及转移状态无明显关系，而与AFP有关联。结论 p16基因和DAPK基因启动子异常甲基化参与了PLC的发生发展过程，并可作为PLC早期辅助诊断的分子标志物之一。 【关键词】 原发性肝癌 p16基因 DAPK基因 血清 DNA甲基化 　　0 引言 　　p16基因是一个重要的肿瘤抑制基因[1]，参与细胞周期的调控，控制细胞生长和分化。死亡相关蛋白激酶（deathassociated protein kinase,DAPK）基因是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是凋亡的正性调节因子之一[2，3], 现已发现在多种肿瘤组织存在p16和DAPK基因启动子的甲基化，提示这些基因的甲基化可能与肿瘤的发生发展有关。本文运用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测原发性肝癌（PLC）患者血清循环核酸中DAPK基因、p16基因甲基化的状况，并探讨检测血清DAPK基因、p16基因甲基化的临床意义。 　　1 资料与方法 　　1.1 研究对象 64例PLC患者均为住院病例，其中男性44例，女性20例，年龄38～82岁，中位年龄64岁。所有病例均有组织病理学和/或细胞学诊断依据。按1997年UICC标准分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期23例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例(其中25例接受手术治疗)。HBsAg阳性的36例，阴性为28例；AFPgt;400ug/L的30例，31μg/L 　　所有病例均于入院后次日留取血清标本，其中手术病例在术后2周留取第二次血清标本，所有标本保存于30℃冰箱待检。 　　1.2 试剂与仪器 DNA提取及清洁使用杭州维特洁生化公司提供的试剂盒；Taq酶购自Promega公司；DNA分子量Marker购自华美生物工程公司；电泳琼脂糖为Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。主要仪器包括PTC100型PCR仪,ECPS3000/150电泳仪，TXT20M凝胶成像系统(UVP)等。 　　1.3 DNA制备 试剂盒提取DNA，紫外分光光度计测定DNA含量，吸光度A260/A280gt;/1.8。 　　亚硫酸处理按照Hermans的经典方法[4]，处理后DNA标本用清洁试剂盒纯化，所得DNA用3mol/L氢氧化钠碱化，冷乙醇沉淀，适量双蒸水溶解修饰处理的DNA，立即扩增或20℃保存。 　　1.4 PCR反应体系 见表1。 　　表1 PCR引物[5]：引物顺序及PCR产物大小（略） 　　*M=methylatedspecific primers；U=unmethylatedspecific primers 　　PCR扩增：反应总体积50μl ，反应体系为：甲基化处理过的DNA模板5μl, 6mmol/L MgCl2, 1.6μmol/L PCR primers, 2.5units HotStar Taq DNA polymerase (Promega), 0.1mmol/L dNTP5。循环参数：96℃变性5min,后加入Taq酶，接着96℃ 45s，62℃ 50s，72℃ 90s，循环35个循环，最后72 ℃ 延长10min。 　　水代替DNA作为空白对照，健康献血者DNA作为未甲基化分析的阳性对照，外周血中的淋巴细胞的DNA经SssI甲基化酶处理后作为甲基化分析的阳性对照。扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳，紫外光照显带。 　　1.5 统计学处理 用SPSS10.0软件进行分析，不同组别DAPK基因甲基化检出率的比较采用R×C表χ2检验。 　　2 结果 　　2.1 不同组别两基因甲基化检出率的比较 64例PLC患者血清经MSP法检测后，49例在p16基因5端启动子区域的CpG岛存在甲基化，见图1。检出率为76.6％；26例在DAPK基因5端启动子区域的CpG岛存在甲基化，见图2。检出率为40.6％；而20例正常人和15例良性肝部疾病患者血清均未检出两基因甲基化，PLC患者与正常人和良性肝部疾病患者血清两基因甲基化检出率比较有显著性差异（Pp16=0.000，PDAPK=0.000）。 　　2.2 两基因甲基化检出率与HBsAg的关系 HBsAg阳性组血清p16基因和DAPK基因甲基化检出率分别为75.0％（27/3