Western Blot配方和方法.docVIP

Western Blot 配液： 10% SDS溶液(/v)： SDS 0.1g DDH2O 1ml 加热溶解，室温保存ml 由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200微升EP分装，4℃保存4W，-20℃保存1月） 1× 电泳缓冲液 Tris base 3.028g Glycine 14.4g SDS 1.0g 用蒸馏水溶解至00ml，调整PH 8.3。甘氨酸g Tris base 15.14g DDH2O 400ml 加水至500ml，0ml甲醇，加至总量1LTris base 3.03g Glycine 14.42g 甲醇 150ml 加水定容至1000ml 10 × TBS： Tris base 12.1g NaCl 40g 加水，用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml TBST： 1 × TBS/吐温 = 1000/1 封闭液： 脱脂奶粉 2g TBST 40ml 配胶：先配分离胶，再配积层胶。 一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整） 2ml 5%积层胶 3ml 5%积层胶 5ml 8% 分离胶 5ml10% 分离胶 10% 两块胶 5ml15%分离胶 超纯水 1.4 2.1 2.3 1.9 2.85 1.1 30％Acr/Bic 0.33 0.495 1.3 1.7 2.55 2.5 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 1.3 1.3 0.95 1.3 1 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.25 0.375 10％SDS 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 10%APS（过硫胺酸） 0.02 0.03 0.05 0.05 0.075 0.05 TEMED 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.002 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29配制时，SDS有效分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。 步骤： （1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2） 配胶与上样：先配分离胶，再配积层胶。 1、 玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧（一定要对齐，以免漏胶）。然后垂直卡在夹子上准备配胶。 2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层去离子水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） 3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上的水，再用去离子水洗涤数次，并用滤纸将水吸干。 4、 按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。待到浓缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内（若只跑一块胶，则槽的另一边要垫一块塑料板，且有字的一面朝内）。在上下槽内加入电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 5、 用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形） 可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周。 6、制备样品：测完蛋白浓度后，计算含20—50μg蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量，一般为40—50ug。）的样品体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×（上样缓冲液与样品蛋白体积