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亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化 菠萝蛋白酶的研究* 谭玉龙，刘晨光，刘成圣，于乐军 （中国海洋大学 海洋生命学院，青岛　266003） 酶的固定化技术有很多优点，它可以显著提高酶的活力和稳定性，使酶可以在极端的pH和温度下进行反应。不同的剂型已应用于酶的固定化，比如薄膜（Tanioka et al. 1998, Arica 2000），微球（Wu et al. 2005），纳米粒（Akiyoshi et al. 1998, Li et al. 2003, Tang et al. 2007）等。最近，纳米材料因为其特别的性质与广泛的应用已越来越多地引起人们的关注，纳米胶束和纳米粒已被用于固定化酶。 由聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物制备的纳米胶束可用来包埋酶分子（溶菌酶、胰蛋白酶）（Harada et al., 1998, 2001, Yuan et al. 2005）。Sunamoto的研究小组（Akiyoshi et al. 1998）曾合成了普鲁兰糖的胆甾烯基et al. 2005），这与氯键疏水作用力以及离子相互作用有关。但固定化酶的性质（比如稳定性、动力学常数等）还需要进一步研究。 本文作者采用亚油酸修饰羧甲基壳聚糖，通过超声的方法制备凝胶纳米粒。选择菠萝蛋白酶应用于实验——因为其在动物炎症及人类炎性肠病1. 化学试剂 壳聚糖（低分子量），亚油酸（LA），1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC），菠萝蛋白酶均购于Sigma公司。其他试剂都采用分析纯。 2. 制备方法 （1）制备羧甲基壳聚糖（CMCS） Na型羧甲基壳聚糖的制备：称取5g壳聚糖于三口烧瓶中，加入100ml水/异丙醇（v/v=1/1），搅拌，使其溶胀。加入6.75g NaOH，50℃搅拌1h。让壳聚糖在碱性条件下膨胀, 形成碱化中心。将7.5g氯乙酸溶于10ml异丙醇，溶解后加到分液漏斗，向三口烧瓶中滴加，控制滴加时间30min, 50℃搅拌4h。反应结束后，布氏漏斗抽滤，70%、80%、90%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入60℃烘箱烘干, 即得白色粉状羧甲基壳聚糖（Na型）。 H型羧甲基壳聚糖的制备：称取2.5g Na型羧甲基壳聚糖，加入100ml 80%乙醇水溶液，搅拌。再加入10ml 37% HCl溶液，搅拌30min。布氏漏斗抽滤，70%、80%、90%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入60℃烘箱烘干,即得白色粉状羧甲基壳聚糖（H型）。 （2）制备亚油酸羧甲基壳聚糖（LA-CMCS） 首先取1g羧甲基壳聚糖溶解于100ml 1%的醋酸溶液(pH4.6)中，然后分别取1ml、1.5ml、2ml亚油酸溶于100ml甲醇中。将两溶液混合，加1mlEDC，搅拌24h后，加入200ml甲醇/氨水（体积比为7：3），搅拌，5000rpm/s，离心30min，去除上清。将沉淀分别用甲醇洗两次，乙醚洗一次，每次洗涤后都要进行5000rpm/s，离心30min，去除上清。室温真空干燥24h。 （3）制备负载菠萝蛋白酶的LA-CMCS纳米粒 10mg LA-CMCS悬浮于10ml PBS缓冲液(pH7.4)。冰浴中用探头超声(Utralsonic homogenizer UH-600)，超声重复两次得到澄清透明溶液(20W，工作10S，停2s)。加入不同浓度的菠萝蛋白酶溶液，然后再分别超声两次。 （4）载药量和包封率 将不同浓度的菠萝蛋白酶溶液加到1ml 0.2mg/ml的纳米粒溶液中，浓度从0.05mg/ml到0.4mg/ml。将混合液超声，然后超滤，得到固定化酶。通过检测未固定化的酶含量来计算纳米粒对酶的的负载量与包封率。 载药量=（A-B）/C×100 包封率=（A-B）/A×100 A为加入的菠萝蛋白酶含量；B为超滤后未固定化的菠萝蛋白酶含量；C为冷冻干燥后的纳米粒质量。 （5）测定自由酶和固定化酶的酶活力 取2ml酶液加入试管中,然后加入1%的酪蛋白溶液3ml,准确保温37℃反应10min,再加入5ml三氯乙酸以终止反应, 摇匀。 空白试样,方法同上,仅在加酪蛋白溶液之前,先加入5ml三氯乙酸使酶失活,再加入酪蛋白溶液。 以空白样做对照,用分光光度计280nm波长测定试样的吸光度(O.D)。结果取三次测定的平均值。 （6）菠萝蛋白酶活力单位 将一个酶活力单位在实验条件下 (pH7.37℃时，反应10min）水解酪蛋白产生溶于三氯乙酸的酪氨酸时所需要的酶量。417.8 ± 17.8 nm (Liu et al. 2007)。透射电子显微镜照片显示纳米粒有完整的圆形结构（图2）。 2. 纳米粒的载药量与包封率 纳米粒对菠萝蛋白酶的负载量与包封率如表1所示，一方面，随加入酶的浓度的增加，从0.05到0.3mg/ml，纳米粒的包封率逐渐下降