细胞工程6原生质体培养和植物体细胞杂交.pptVIP

细胞工程 课程初步安排：36学时第一章 　绪论 4个学时第二章 　实验室配置及基本技术 2个学时第三章 植物细胞工程的理论基础 4个学时　第四章 　植物组织器官培养技术 6个学时第五章 　植物细胞培养及次生代谢产物生产 3个学时第六章 　原生质体培养和体细胞杂交 3个学时第七章 　人工种子 1个学时第八章 　植物种质资源离体超低温保存 1个学时第九章　　动物组织培养　　　　　　　　　 3个学时第十章　　动物细胞融合与单克隆抗体 4个学时　　　第十一章　动物组织与胚胎工程 1个学时　　　　　　第十二章　试管动物与克隆动物 2个学时 据统计，自1971年Takebe首次报道从烟草叶肉原生质体再生植株后，已有49个科160多个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但已开始从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 外植体材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射以及预培养等方法，可以提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同： --龙胆试管苗只有用4℃处理后分离的原生质体才能分裂； --甘蔗植株只有在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂； --马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。 酶 来 源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R–10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 根霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲霉 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 根霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 沉降法 方法：将收集的滤液低速离心，使原生质体沉降于管底。转速 的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中 为准，一般为500～800r/m下离心3～5min。用吸管小心地吸取 上清液，再用洗涤液洗原生质体3次，最后用培养基洗涤1次， 调整到一定密度后进行培养。 漂浮法 方法：将收集的滤液于1000r/m的转速下离心10min，原生质体 将漂浮于溶液的表面，细胞碎片等杂质将下沉到管底。用吸管 吸出原生质体并转入到另一离心管中，反复3次，用培养基洗涤 1次后调整到所需密度进行培养。 界面法－梯度离心法 方法：采用两种比重不同的溶液，离心后使完整无损的原生质 体处在两液相的界面之间,而细胞碎片等杂质沉于管底。用此法 可获得更为纯净的原生质体。 1. 荧光素双醋酸酯(FAD)染色法 二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)染色法 FDA本身无荧光，无极性，能透过细胞质膜，一旦进入原生 质体后能在内酯酶作用下分解形成有荧光的极性物质－荧光素 荧光素不能自由穿越细胞质膜而积累在原生质体当中，在荧光 显微镜下观察时，凡发淡绿色荧光的是有活力的原生质体，无 荧光或荧光很微弱的已经死亡或活力低的原生质体。 液体浅层培养 固体培养－－琼脂（糖）平板培养或包埋培养 液体浅层-固体平