尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建和鉴定.pdfVIP

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2017-09-06 发布于贵州
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尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建和鉴定.pdf

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尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建和鉴定

摘要摘要目的：构建尤文肉瘤EWS．FLll基因原核表达质粒。方法：序列，目的基因两侧引入SacI和Hind III酶切位点，克隆至pMDl8．T载体中，转化大肠杆菌JMl09，筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定。再将表达，经SDS．PAGE电泳后转印到NC膜上，进行Westemblot鉴定。结果： PCR结果显示扩增片段大小约为1．5kb，双酶切鉴定目的基因片段大小约为 1．5kb，阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同。所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54kDa蛋白，经Westem blot鉴定系 EWS．FLll蛋白。结论：功能奠定了基础。 [关键词]：EWS—FLll融合基因尤文肉瘤原核表达质粒 Il Abstract ABSTRACT Objective： To sarcomaEWS—FLI1 vector． construct Ewing’S geneprokaryoticexpression 。 Methods： The ofEWS·FLI1 wasobtainedRT-PCRmethodafterthetotalRNAwas gene by target cells．Thesite ofrestrictiveendonuclease extractedfrom sarcomaA673 sequences Ewing’S Hind111wereintroducedintothe anddownstreamof SacI and upstream targetgenerespectively． The wereclonedinto 18-TandtransformedintoE．ColiJM1 09．Screened fragment pMD targetgene endonucleaseandDNA clonesWereconfirmedPCrestrictive sequencing． positive by digestion 1 was subclonedinto vector the TheEWS-FLI sequentially prokaryoticexpressionpQE30，and gene recombinant 1 wasconfirmedrestrictiveendonucleaseand plasmidpQE30·-EWS··FLI by digestion 1 withEWS—FLI1