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实习四 食品中总抗坏血酸测定 （荧光法） （一）目的意义 食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。当食物放置时间较长或经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸仍有85％左右的维生紊C活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。 （二）原理 样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。脱氢型抗坏血酸与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。 （三）仪器与试剂 1. 荧光分光光度计或有338nm及340nm波长的荧光计 2. 捣碎机 3. 100ml容量瓶，锥形瓶，具塞试管。 4. 偏磷酸一乙酸液 称取30g偏磷酸（HPO3），溶于80ml冰乙酸中，加500ml蒸馏水混匀，稀释至1000ml。于4℃冰箱可保存7～10天。 5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液 制法同4，只是用0.18mol／L硫酸代替蒸馏水。 6． 醋酸钠溶液 溶解500g醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至1000ml。 7. 硼酸一醋酸钠溶液 溶解3g硼酸于100ml醋酸钠溶液中，临用前配制。 8. 邻苯二胺溶液 称取20mg邻苯二胺，于临用前溶解至100ml。 9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液 称取0.lg百里酚蓝，加0.02mol／L氢氧化钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是10.75ml，研磨溶解后的溶液用水稀释至250ml。 10．活性炭的活化 加200g碳粉与lL盐酸浓溶液（1份盐酸＋9份水），加热回流1～2小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。 11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml） 精确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸—乙酸液溶解至50ml容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）。 12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml） 取10ml抗坏血酸标准液用偏磷酸—乙酸液稀释至100ml。定容前测试pH，如pH＞2．2，则选用偏磷酸—乙酸—硫酸液稀释。 （四）操作步骤 l. 样品处理 称100g样品加100ml偏磷酸—乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度，如呈红色，立即用偏磷酸—乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色则用偏磷酸—乙酸—硫酸溶液稀释。匀浆的取样量需根据样品中抗坏血酸的含量而定，当样品中含量在40~100ug之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸一乙酸或者偏磷酸一乙酸一硫酸液稀释至100ml，过滤，滤液备用。 2．氧化处理 分别取样品滤液和抗坏血酸标标准应用液各80ml于200ml具塞锥形瓶中，加2g活性炭，用力振摇1分钟，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液待测定。 3．各取10ml标准氧化液于2个100ml容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。 4. 各取10ml样品氧化液于2个100ml容量瓶中，分别标明“样品”及“样品空白”。 5．于4标准空白”及“样品空白”溶液中各加入5ml硼酸—乙酸钠溶液，混合振摇15min，用蒸馏水稀释至100ml，在4℃冰箱中放置2～3h，取出备用。 6．于“样品”及“标准”溶液中各加入5m1 50％醋酸钠溶液，用水稀释至100ml，备用。 ⒎ 标淮曲线的制备 取上述6．“标准”溶液（抗坏血酸含10ug／ml）0.5、1.0、1.5、和2.0ml分别置于10ml具塞试管中，再用水补充至2.0ml。每一浓度分别作两个平行样对照。 8. 取“标准空白”溶液、“样品空白”溶液及“样品”溶液各2ml分别置于10ml具塞试管中。 9. 在暗室中迅速向各管中加入8ml邻苯二胺溶液，振摇均匀，在室温下反应35min，于激发波长338nm，发射波长420nm处测定荧光强度。 （五）结果计算 式中：A—标准管荧光读数 B—标淮空白管荧光读数 C—样品管荧光读数 D—样品空白管荧光读数 S—标准管中抗坏血酸浓度 F—样品稀释倍数 W—取样量，g 10—荧光反应所用试样体积，ml 1／1000—将抗坏血酸的ug数折算为mg数 （六）说明 1．处理活性炭时，可取活性炭洗涤滤液少许，加数滴5％亚铁氰化钾，若不出现蓝色，即无Fe3＋存在，或滴加数滴1％硫氰化钾，若不出现红色，也证明没有Fe3＋存在，将活性炭滤干水分后置烘箱内烘干，冷却后置干燥箱中备用。 2. 生食物匀浆时会产生泡沫，为定容准确可加数滴异戊醇除去。 3. 百里酚蓝指示剂变色范围 pH l.2，红色；pH 2.8，黄色；pH＞4，蓝色。