复制型载体(YRp).PPTVIP

Ti plasmid is a circular plasmid that often, but not always, is a part of the genetic equipment that Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes use to transduce its genetic material to plants. The Ti plasmid is lost when Agrobacterium is grown above 28°C. Such cured bacteria do not induce crown galls, i.e. they become avirulent. pTi and pRi share little sequence homology but are functionally rather similar. The Ti plasmids are classified into different types based on the type of opine produced by their genes. The different opines specified by pTi are octopine, nopaline, succinamopine and leucinopine. The plasmid has 196 genes that code for 195 proteins. There is no one structural RNA. The plasmid is 206,479 nucleotides long, the GC content is 56% and 81% of the material is coding genes. There are no pseudogenes. The modification of this plasmid is very important in the creation of transgenic plants, but only in dicotyledon plants. * 大多数双子叶植物受伤后会产生一种叫丁香酮(acetosyringone)的物质，这时土壤农杆菌感染后，丁香酮在Ti质粒上Vir A的产物A的协同作用下促进了Vir G产物G的活化(即磷酸化)，然后产物G相继激活Vir B、V ir c、Vir D、Vir E等操纵子，特别是Vir D和Vir E。前者产生两种蛋白，D1为缺刻酶(nickase)，它能特异性地在T—DNA两端产生缺刻；D2则是一种蛋白复合物，它粘在已断开的T—DNA的两端，具“导航”的功能，有人认为它是Rec A，起重组的作用。后者产生单链结分蛋白(SSB)，有保护缺刻产生后的T—DNA的功能。T—DNA在诸多蛋白的导航、保护下重组进核基因组。 * Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合） * 最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850 * 胭脂碱合成酶(NOS)启动子 。 植物的选择性标记： 双子叶植物用卡那霉素，单子叶植物都具有卡那霉素的抗性，经常选择潮霉素或膦丝菌素 。 * 三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。 * 用三亲交配法将中间质粒转入农杆菌的过程需要三种细菌，即含有中质粒的大肠杆菌供体菌，含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌(helper) 和根癌农杆菌受体菌。当这三种菌混合时，协助质粒pRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动(mol)和转移(tra)功能，把供体的中间质粒转移进根 癌农杆菌内。该系统中中间质粒需要带有一个特定的转移起始点(ori)和活化位点(bom)，以使协助质粒的游动和转移基因对它起作用，被驱动转移。三亲 结合使用的受体根癌农杆菌一般带有染色体抗性标记，如抗利福平(Rif)，供体质粒（中间质粒）常带有抗Km, St, Tc或Ap标记，这样利用Rif+Km选择转移接合子。受体农杆菌所含的Ti质粒应是解除武装的卸甲Ti质粒。 * 人体细胞是SV40的半受纳细胞(semi-permissive cell)，因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%～2%会产生出感染性的病毒。 * 应用这种复制功能缺陷的SV40病毒突变株转化人的成纤维细胞。同样也获得了一种其功能与COS细胞类似的新型的细胞系HFS(human fibroblasts，SV40)。 * 改造后的Ti质粒载体模式 Left Right MCS AMP