乙烯利对泥鳅5种组织酯酶同工酶表达影响.docVIP

乙烯利对泥鳅5种组织酯酶同工酶表达影响摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳，在试验水温23～25 ℃的条件下，研究了乙烯利（ETH）对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）5种组织酯酶（EST）同工酶表达的影响。结果表明，经不同浓度乙烯利处理后，在不同染毒时间下泥鳅5种组织EST同工酶酶谱发生了不同程度的变化，变化的类型包括：酶带的缺失、新增及着色的深浅，5种组织EST同工酶的表达具有明显的组织差异性，活性由强至弱依次为：脾脏肝胰脏鳃心脏肌肉；没有发现剂量梯度与EST同工酶表达的正相关变化，在不同染毒时间下，脾脏、肝胰脏、鳃组织EST同工酶基本上表现为在24 h活性增强，48 h活性达到最弱，72 h略有增强，96 h又减弱，而心脏和肌肉组织24 h先增强，而后一直减弱的趋势，表现出明显的组织差异性和应激性。 关键词：泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）；乙烯利；组织；酯酶；同工酶 中图分类号：X503.225；R155.5 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4325—05 乙烯与果实成熟有着密切的关系，被认为是果实成熟激素。乙烯利（Ethrel，ETH）化学名称为2—氯代乙基膦酸，是一种人工合成的乙烯释放剂，其作为植物生长调节剂具有用量小、见效快、残留少等特点，广泛用于保护地反季节早熟植物栽培[1—3]。近年来，由于存在乙烯利的滥用及随意提高使用浓度、盲目改变使用时间等现象，乙烯利在果蔬中的残留已经成为影响果蔬食用安全的因素之一[4]。另有研究表明[5]，乙烯利具有一定的神经毒性和弱激素样作用。国外对水果、蔬菜中残留的乙烯利有严格的限量要求，欧盟必威体育精装版规定其最高残留限量为0.02 mg/kg[6]。于文辉等[4]研究表明，乙烯利对小鼠体细胞和生殖细胞具有致突变作用。但关于乙烯利对鱼类组织同工酶表达的影响目前鲜见报道。 同工酶技术可指示一些具有特异性的同工酶带，定性地反映环境中的污染物。酯酶（EST）同工酶能水解大量非生理存在的酯类化合物，包括某些药物，具有解毒作用。在环境毒物存在的情况下，多种动植物EST同工酶的表达都会有显著的变化[7]。环境科学多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究环境污染物对生物同工酶表达的影响[8，9]。本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在水温23～25 ℃的条件下，研究了乙烯利对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）5种组织EST同工酶表达的影响，旨在为生活生产中合理使用乙烯利提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 试验用泥鳅购自世纪华联超市，选择体格健壮、体表无伤、规格一致的泥鳅，平均体长为（14.56±0.35） cm，平均体重为（27.00±0.26） g。试验前将泥鳅放入曝气自来水中驯养1周，每天换1次水。乙烯利（分析纯）购自上海化学试剂采购供应五联化工厂。 1.2 方法 1.2.1 染毒试验 根据急性毒性试验结果，以96 h全部存活浓度为最低浓度，全部致死浓度为最高浓度，将试验分为3个试验组和1个空白对照组，每组15尾泥鳅。试验组乙烯利浓度依次为0.06、0.07、0.08 mg/L，空白对照组不添加乙烯利。染毒试验在室内容积为10 L的棕色玻璃缸中进行，每个玻璃缸加入相应处理液4 L，对照组加入曝气自来水，每24 h换液1次。染毒时间为96 h。试验期间不投饵，仅用简易增氧机进行增氧，水温23～25 ℃，pH 7.3，发现死亡个体及时清除。 1.2.2 采样 每隔24 h分别从对照组和各试验组随机捞取2尾泥鳅，擦干体表水分，将泥鳅置于盛满冰的解剖盘上解剖，取出心、鳃、脾、肝胰脏、肌肉5种组织，用预冷的无菌蒸馏水冲洗以除去组织血污，然后用滤纸吸去多余水分。分别取上述5种组织称重，将组织放入研钵按1∶2的比例（质量体积比，g/mL）加入0.02 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，置于冰上研磨成糊状匀浆。将研磨好的组织倒入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清液于—20 ℃保存，供同工酶电泳分析用。 1.2.3 电泳 采用周宗汉等[10]的方法制备凝胶，浓缩胶浓度为3.0%，分离胶浓度为7.4%，电极缓冲液为Tris—甘氨酸溶液（pH 8.3）。每孔点样量为10 μL。电泳时，指示剂（溴酚蓝）在浓缩胶内时用70 V电压，当指示剂完全进入分离胶后，将电压升高到150 V，电流控制在15 mA。电泳时间为8 h左右。整个电泳过程于4 ℃进行。 1.2.4 染色 染色液配方参照季维智等[11]的方法。电泳结束后将凝胶取出，用蒸馏水冲洗干净，放入基质染色液中染色，直至清晰条带出现（约5～10 min）。显色完成后用蒸馏水将凝胶